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2011微生物实验考试幻灯片秋季实验-4



(1)半固体培养基的接种







1、综合性实验:肠道杆菌的检测与鉴定(3)

(2)生化反应(糖发酵、IMViC、硫化氢、尿素酶) 2、综合性实验:细菌的耐药性检测与机制探讨(2) 细菌质粒的接合 麦康凯氏实验(R因子的传递)

3

、综合性实验:真菌的培养与鉴定 (1)真菌形态观察 白色念珠菌(革兰氏染色)新型隐球菌(墨汁负染法)

(2)真菌的培养 大培养(酵母型、类酵母型和丝状菌落)
小培养(大、小分生孢子) 4、病毒的形态学 细胞病变(HSV)

包涵体(狂犬病毒内基氏小体)
5、综合性实验:流感病毒分离培养与鉴定 血凝实验与血凝抑制实验(流感病毒)

1、肠道菌的分离与鉴定3 Result Demonstration结果示教: (1)Inoculation of Semi-solid Agar Medium半固体培养基的接种 (2)Biochemical reactions生化反应(sugar fermentations糖发酵、 IMViC、Hydrogen sulfide 硫化氢(H2S)、Urease尿素酶)

(1)Inoculation of Semi-solid Agar Medium半固体培养基的接种 穿刺接种法:接种针 半固体培养基 试验菌(大肠杆菌、痢疾杆菌) 目的:动力检查,是否有鞭毛

B

A

肠道细菌的动力学检查

(2)Biochemical reactions生化反应 sugar fermentations糖发酵

IMViC
Hydrogen sulfide 硫化氢(H2S) Urease尿素酶

sugar fermentations糖发酵

当细菌分解某种糖类时, 能够产酸(+),使pH指示剂(溴甲酚紫) 变成黄色, 有些不但能产酸还能产气( ),使糖发 酵管中的小倒管充有气泡; 有些指示剂保持原来的紫色(—)。

sugar fermentations糖发酵

阴性

产酸产气

产酸不产气



+

五糖发酵管











The IMViC Series
The Indole Test 吲哚(靛基质)试验 The Methyl Red Test 甲基红试验 The Voges Proskauer Test VP试验 The Citrate Utilization Test 枸橼酸钠利用试验

The Indole Test 吲哚(靛基质)试验

The indole test examines the ability of a bacteria to breakdown the amino acid trytophan色氨酸. The presence of indole is confirmed by the addition of a few drops of Kovac's Indole reagent二甲基氨基苯甲 醛. The red layer at the top indicates a positive test. 在培养基中加入二

甲基氨基苯甲醛(靛基质试剂),能和靛基质结合,形成红色化合物(玫瑰吲哚)

The Methyl Red Test,The Voges Proskauer Test 原理: 葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 混合酸(甲酸、乙酸) KOH+空气 氧化 二乙酰 pH<4.5 ?-奈酚 +蛋白胨水 起催化作用 中的精氨酸 甲基红指示剂 所含有的胍基 红色化合物 红色(VP试验阳性) (甲基红试验阳性)

方法: 结果:红色为阳性 应用:肠杆菌科细菌的鉴定

The Methyl Red Test甲基红试验

The Methyl Red Test examines a bacteria ability to ferment glucose to produce "many acids". Such bacteria are known as mixed acid fermentors发酵罐because they lower the pH of the medium to below 4.8, the point at which the indicator methyl red is truly red.

The Voges Proskauer Test VP试验

In the butylene-glycol丁烯-乙二醇fermentation pathway, glucose is converted to acetylmethylcarbinol乙酰甲基甲醇(AMC) and finally to butylene glycol. The addition of alph naphtholα-萘酚and potassium hydroxide氢氧化钾tests for the presence of AMC. The red tube on the right is positive.

The Citrate Utilization Test 枸橼酸钠利用试验

Bacteria that can utilize citrate incorporate it aerobically producing alkaline end products. The pH indicator contained in Simmons Citrate Agar is bromthymol blue溴麝香草酚兰. A blue slant indicates a positive reaction.
如细菌可利用枸橼酸盐作为唯一碳源,能在西蒙氏枸橼酸盐培养基上生长, 细菌生长时,分解枸橼酸钠,生成碳酸钠,使培养基变碱。在培养基中加 入了pH指示剂溴麝香草酚兰,培养基由绿色变成蓝色。

The Hydrogen Sulfide Test 硫化氢试验(H2S)
某些细菌能分解培养 基中的含硫氨基酸, 生成硫化氢,而培养 基中含有铅盐或铁盐, 形成黑褐色的硫化铅 或硫化铁沉淀。

The Urease Test 尿素酶试验

某些细菌具有尿素酶,能分解形成大量的氨,使培养基酸碱度 上升呈碱性,酚红指示剂呈红色,为阳性。

记录肠道菌分离与鉴定的过程,并分析试验结果

肠道杆菌的分离与鉴定步骤

粪便(或肛拭)

增菌培养基

SS琼脂平板或其他肠道选择培养基

动力检查、IMViC、双糖铁培养基、血清反应等

生化反应

2、细菌质粒的接合(结果示教):

MacConkey test麦康凯实验 (R因子的传递 ,transfer of R factor)
实验原理:
细菌耐药性基因位于质粒或染色体上,可通过转

化、转导、接合等方式进行传递。在肠道杆菌中,带有
可传递的耐药性质粒(resistance plasmid, R),这种R 质粒可通过接合方式由供体菌传给受体菌,使受体菌也

获得相应的耐药性。

实验材料:
1、菌种:供体菌(大肠杆菌耐药株)和受体菌(大肠杆菌敏感株); 2、培养基:肉汤管、麦康凯氏培养基(含氯霉素20微克毫升)

实验方法:
1、将幼稚供体菌及受体菌(培养6~12hr)分别吸0.1毫升于1毫升肉汤管中混 合,置37℃培养1~2hr; 2、用接种环将混合菌液划线接种于麦康凯氏培养基上,37℃培养24hr后观察 结果。 3、同时分别划线接种未混合的供体菌和受体菌于麦康凯氏培养基表面, 37℃ 培养24hr作为对照。 4、结果观察:供体菌()在麦康凯氏培养基上长成无色菌落,而受体菌()

长成红色菌落。由于本实验所用受体菌(大肠杆菌)菌株对氯霉素敏感,所
用不能在含氯霉素的培养基上生长。但经过接合后,由供体菌将氯霉素耐 药性质粒传给了受体菌,因此可以在含氯霉素的麦康凯氏培养基上长成红 色菌落。

实验结果
培养基:MacConkey Agar (含氯霉素) 供体菌:鼠伤寒杆菌 (无色菌落) 受体菌:大肠杆菌氯霉素敏 感株(不能生长) 变异菌:大肠杆菌氯霉素耐 药株(红色菌落)

耐药性质粒resistant plasmid

3.Morphology and staining of fungi真菌形态染色 Glass Slide Demonstration示教玻片

Candida albicans (Gram stain)白色念珠菌

新型隐球菌(墨汁负染法)

真菌大培养法
真菌大培养法是将真菌放入含沙 保氏麦芽糖或葡萄糖培养基的平皿 或试管中进行培养的一种方法。可 以观察真菌的基本菌落形态:酵母 型菌落、类酵母型菌落、丝状菌落。

Cultivation of fungi 真菌的培养 colony morphology on slants(yeast type, yeast-like type,filamentous type)大培养(酵母型、类酵母型、丝状菌落) Result Demonstration结果示教

真菌小培养法
真菌小培养法,又称玻片培养法。 是将一小块沙保培养基放置玻片 上,挑取小片真菌菌落接种至培 养基周边的一种真菌培养法。可 以直接真实地观察菌丝与孢子生 长的关系,对菌种的分类与鉴别 有较大帮助。

microconidium (小分生孢子)

macroconidium(大分生孢子)

4.Morphology of virus病毒的形态学 Glass Slide Demonstration示教玻片 cytopathogenic effect细胞病变(单纯疱疹病毒) 细胞病变(CPE)又称致细胞病变作用。病毒在细胞 或组织中生长后,使细胞发生退行性变性,细胞形态 学发生变化,常见的有:细胞变圆、坏死、溶解或脱 落等。

正常上皮细胞

单纯疱疹病毒感染的病变细胞

Inclusion Body(Negri body)包涵体 (狂犬病毒内基小体)

? 包涵体:系位于病毒感染的宿主细胞浆或核内, 一至数个不等,嗜酸性或嗜碱性小体。病毒复 制或转录过程中形成的复合物、病毒装配过程 中出现的中间体,以及核衣壳等均可在宿主细 胞的某一部分聚集而形成包涵体。 ? 狂犬病毒包涵体,又称内基氏小体,系感染狂 犬病毒的动物神经细胞浆内,一个或数个、圆 形或椭圆形的嗜酸性小体。

蚀 斑
病毒在活细胞内复制后,产生 局限性病灶,病灶逐渐变大, 肉眼可见,以活性染料着色细 胞,留下未染上颜色的蚀斑。

正 常 上 皮 细 胞 培 养 物

单 纯 疱 疹 病 毒 感 染 的 细 胞 培 养 物 ( 蚀 斑 形 成 )

5.Serological tests of virus病毒血清学试验 Hemagglutination Test血凝试验(流感病毒) Individual Practice个人操作 Hemagglutination Inhibition Test 血凝抑制试验 (流感病毒) Result Demonstration结果示教

注:血凝试验中使用微量移液器,每两人一把,精密仪器,注意爱护;吸头要求 一次性使用;微量血凝板每两人一块;

? 【结果判读】 ? 各 孔 出 现 的 血 球 凝 集 程 度 以 ++++ 、 +++ 、 ++ 、 +、—表示。 ? ++++为全部血球发生凝集,呈颗粒状薄膜均匀铺 于孔底,边缘不整齐; ? +++约有75%血球发生凝集,边缘不整齐; ? ++约有50%血球发生凝集,红细胞于孔底形成一 个环状,四周有小凝集块; ? +约有25%血球发生凝集,红细胞于孔底形成小团, 但边缘不整齐,四周有小凝集块; ? —不凝集,表现为血球沉于孔底,呈一致密小点, 边缘光滑,圆润。 ? 血凝试验的结果以50%血球凝集(++)的最高病 毒稀释度为试验的血凝滴度,即为1个血凝单位。

作业: 记录肠道菌分离与鉴定的过程,并分析实验结果


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