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河北省邯郸一中2015-2016高中生物选修一 专题5课题1 DNA的粗提取与鉴定 导学案(无答案).doc


专题 5 课题 1 DNA 的粗提取与鉴定
一、基础知识 (一)提取 DNA 的方法 提取生物大分子的基本思路是选用一定的 或 方法分离具有不同物理或化学性质 的生物大分子。对于 DNA 的粗提取而言,就是要利用 DNA 与 RNA、蛋白质和脂质等在 和 性质方面的差异,提取 ,去除其他成分。 (1)DNA 的溶解性: (1)DNA 的溶解性: ? DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同,利用这一特点,选 择适当的盐浓度就能使 充分溶解, 而使杂质沉淀, 或者相反, 以达到分离目的。 ? 此外,DNA 不溶于 溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理, 可以将 DNA 与蛋白质进一步的分离。 (2)DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性: 蛋白酶能水解 ,但是对 DNA 影响。大多数蛋白质不能忍受 60—80oC 的高 温,而 DNA 在 ℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ,但对 DNA 影 响。 (二)DNA 的鉴定 在 条件下,DNA 遇 会被染成 色,因此二苯胺可以作为鉴定 DNA 的试剂。 二、实验设计 (一)实验材料的选取 凡是含有 的生物材料都可以考虑, 但是使用 的生物组织, 成功的可 能性更大。 (二)破碎细胞,获取含 DNA 的滤液 动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的 , 同时用 玻璃棒 ,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要先用 溶解细 胞膜。例如,提取洋葱的 DNA 时,在切碎的洋葱中加入一定的 和 ,进行 充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。 (三)去除滤液中的杂质 方案一 利用 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中 的不同, 通过控制 NaCl 溶液的浓 度去除杂质。 方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉,反应 10~15min,嫩肉粉中的 能够分解蛋 白质。 方案三 将滤液放在 ℃的恒温水浴箱保温 10~15min,注意 范 围。 (四)DNA 的析出与鉴定 1、将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积 、 的酒精溶液(体积分数为 ) , 静置 min, 溶液中会出现 , 这就是粗提取的 DNA。 用玻璃棒 搅 拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。 2、取两支 20ml 的试管,各加入物质的量浓度为 的 NaCl 溶液 5ml,将丝状物放入 其中一支试管中, 用玻璃棒搅拌, 使丝状物溶解。 然后, 向两支试管中各加入 4ml 的 试 剂。混合均匀后,将试管置于 中加热 5min,待试管 后,比较两支试管溶液颜色的 变化,看看溶解有 DNA 的溶液是否变 。 实例:用鸡血细胞液粗提取 DNA 并鉴定(苏教版必修 2) 步骤 操作 图示

1、 提取鸡血 细胞的细胞 核物质 2、 溶解细胞 核 内 的 DNA 3、析出含 DNA 的 粘 稠物 4、滤取含 DNA 的 粘 稠物 5、将 DNA 的粘稠物再 溶解 6、过滤含 DNA 的 氯 化钠溶液 7、 提取含杂 质较少的 DNA

将制备好的鸡血细胞液(已在课前配好)5~10mL,注入到 50ml 烧杯中。向烧杯中加入 20mL,同时用玻璃棒沿一个 方向快速搅拌 5min,然后,用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至 1000mL 的烧杯中,取其滤液。 将物质的量浓度为 40 mL 加入到滤液中,并作玻 璃棒沿一个方向搅拌 1min, 使其混合均匀, 这时 DNA 在溶液中 呈溶解状态。 沿烧杯内壁缓缓加入 ,同时用玻璃棒沿一个方向 不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水, 溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加 入蒸馏水。 用放多层纱布的漏斗,过滤溶液至 1000 mL 的烧杯中。取 纱布上的 。

取一个 50 mL 烧杯,向烧杯内注入物质的量浓度为 20 mL 。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至 NaCl 溶液中,用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌 3min,使黏稠物 尽可能多地溶解于溶液中。 取一个 100 mL 烧杯, 用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。 取其滤液(DNA 溶于 中) 。

在上述滤过的溶液中,加入 的、体积分数为 50 mL (加入时动作要慢) , 并作用玻璃棒沿一个 方向搅拌, 溶液中会出现含杂质较少的丝状物。 当玻璃棒上出 现丝状物缠绕时,继续慢慢搅拌,至不再增加时,用玻璃棒将 丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。 5mL,将 8、DNA 的 取两支 20 mL 的试管,各加入物质的量浓度为 丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。 鉴定 然后,向两支试管中各加入 4 mL 的二苯胺试剂。混合均匀后, 将试管置于沸水中加热 5min,等试管冷却后,观察并且比较两 支试管中溶液颜色的变化。 三、操作提示 1、以血液为实验材料时,每 100ml 血液中需要加入 3g ,防止 。 2、加入洗涤剂后,动作要 、 ,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地 操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要 ,以免加剧 ,导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要 ,否则会影响鉴定的效果。 四、课题成果评价 1、是否提取出了 DNA 观察你提取的 DNA 颜色,如果不是白色丝状物,说明 DNA 中的 较多;二苯胺鉴 定出现蓝色说明实验 ,如果不呈现蓝色,可能所提取的 DNA ,或是实验操 作中出现 ,需要重新制备。

2、分析 DNA 中的杂质 本实验提取的 DNA 粗制品有可能仍然含有 、 、 等杂质。 3、不同实验方法的比较 对于不同的实验方法, 本课题可以采用分组的方法进行研究。 首先选取不同的实验材料, 其次同种材料还可以采用不同方法,从多方面比较实验结果,如 DNA 的 、 , 二苯胺显色的 等,看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。 五、课题延伸 本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物, 在严格的科学实验中很少使用。 实验室提取高 纯度的 DAN 时,通常使用 、 或 等化 学试剂。 【教材答案】 (一)旁栏思考题 1.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂? 答:蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种 液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细 胞 ,再加上搅拌的 ,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂), 从而释放出 DNA。 2.加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么? 答:洗涤剂是一些离子去污剂,能 ,有利于 DNA 的 ;食盐的主要成分 是 NaCl,有利于 。 3.如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响? 答:研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全,提取的 DNA 量 ,影响实验结 果,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 4.此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分? 答:可能含有 、 和 等杂质。 5.为什么反复地溶解与析出 DNA,能够去除杂质? 答:用高盐浓度的溶液溶解 DNA,能除去 ;用低盐浓度使 DNA 析出, 能除去 。因此,通过反复溶解与析出 DNA,就能够除去与 DNA 溶解度 不同的多种杂质。 6.方案二与方案三的原理有什么不同? 答:方案二是利用 分解杂质蛋白,从而使提取的 DNA 与蛋白质分开;方案三利用 的是 DNA 和蛋白质对 耐受性的不同,从而使蛋白质 ,与 DNA 分离。 (二)讨论题 图 5-1 是 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲线,请根据曲线图,思考下面的问题 1.在什么浓度下,DNA 的溶解度最小?DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度是如何变化的? 答: 在 NaCl 溶液浓度为 0.14mol/L 时,DNA 的溶解度最小; 当 NaCl 溶液浓度低于 0.14mol/L 时,随着 NaCl 溶液浓度的升高,DNA 的溶解度 ;当 NaCl 溶液浓度高于 0.14mol/L 时,随着 NaCl 溶液浓度的升高,DNA 的溶解度 。 2.如何通过控制 NaCl 溶液的浓度使 DNA 在盐溶液中溶解或析出? 答:根据 DNA 在 0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度最小的特性,一般先用较高浓度 的 NaCl 溶液使 DNA 溶解,然后再用蒸馏水稀释至 使 DNA 析出。 (三)练习 1.答:提取 DNA 的第一步是材料的选取,其目的是一定要选取 DNA 含量 的生物 材料,否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难;第二步是 DNA 的释放和 溶解,这一步是实验成功与否的关键,要 ;第三步是 DNA

的纯化,即根据 DNA 的 、 对 及 的耐受性的不同等特性,最大限度地 将 DNA 与杂质分开;最后一步是对 DNA 进行鉴定,这是对整个实验的结果的检测。 2.答:提取蛋白质比提取 DNA 的难度大。这是因为,与 DNA 相比,蛋白质对温度、盐浓 度、 pH 等条件要敏感得多, 很容易 ; 并且蛋白质的空间结构 , 理化性质 , 使得蛋白质的提取没有一种统一的方法, 只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件, 设计 特定的方法。 【知识拓展】 1.制备鸡血细胞液时,为什么要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠? 答:制备鸡血细胞液时,要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠, 。其原 理是柠檬酸钠能与血浆中 Ca2+发生反应,生成柠檬酸钙络合物,血浆中游离的 Ca2+大大减 少,血液便不会凝固。 2.鸡血离心或静置沉淀后,为什么要弃出上清液? 答:因为上清液是 ,没有血细胞。DNA 主要存在于试管底部的 中, 所以提取鸡血中的 DNA 时,要除去血液中的上清液。 3.盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器,为什么? 答:鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内 DNA 的含量本 来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的 DNA 就会更少。因此,实验过程中最 好使用 的烧杯和试管,这样可以减少提取过程的 DNA 的损失。 4.为什么析出 DNA 时要用冷却 的酒精? .. 答:预冷的酒精溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶的活性,防止 DNA 降解;二是降 低分子运动,易于形成沉淀析出;三是低温有利于增加 DNA 分子的柔韧性,减少断裂。


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