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1-1 DNA重组技术的基本工具


专题1

基 因 工 程

基因工程的概念
基因工程的别名
操作环境 操作对象

DNA重组技术
生物体外 基因 DNA分子水平

操作水平 基本过程

剪切 → 拼接 → 导入→ 表达

思 考: 自然界是否存在一种生物的DN

A进入另一生 物的情况?

噬菌体侵染细菌的实验。

科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论

艾弗里证明DNA是遗传物质,DNA可从 一种生物个体转移到另一种生物个体。

科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论

沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。

科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论

梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制

科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论
复制 转录

克里克等提出中心法则

翻译

DNA
逆转录

RNA

蛋白质

科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
基 础 理 论

1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的 遗传密码,1966年霍拉纳用实验加以证明。

科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
1)1967年基因转移载体的发现 2)1970年工具酶的发现 3)1977年DNA合成和测序技术的发明

4) 1972年DNA体外重组的实现
5)1973年重组DNA表达实验的成功

6)1980年第一例转基因动物问世
7)1988年PCR技术的发明

第一节 DNA重组技术的基本工具
一. 准确切割DNA的工具(“分子手术刀”) ——限制性核酸内切酶 二. DNA片段的连接工具(“分子缝合针”) ——DNA连接酶 三. 基因转移工具(“分子运输车”) ——基因进入受体细胞的载体

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 主要从原核生物中分离纯化 ⒈主要来源:

思考
? 根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于 原核生物中的作用是什么吗? 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 使之失效,从而达到保护自身的目的。

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” ⒉ 种类与命名:
现在已经从约300种微生物中分离出了约 4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。
大肠杆菌 (Escherichia coli R) EcoRⅠ 粘质沙雷氏杆菌 (Serratia marcesens) SmaⅠ

练习:流感嗜血杆菌的d菌株 ( Haemophilus influenzae d ) 中先后分离到3种限制酶,则分 别命名为: HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

3.作用特点 ——特异性
(1)识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列 (2)在特定的位点切割DNA分子。 大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序 例如: 列, 并在G和A之间切开。

“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
? 限制酶的识别序列:
大多数限制酶的识别序列 由6个核苷酸组成,少数的

能被限制性内切

酶特异性识别的切割 在切割部位,一条链 正向读的碱基顺序与 另一条链反向读的顺 序完全一致。

识别序列由4、5或8个核苷 酸组成

部位都具有回文序列:

切割DNA分子实质是断开两个 核苷酸之间的磷酸二酯键。

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

4.作用结果:产生黏性末端或平末端
EcoRⅠ

限制酶

被限制酶切开的 DNA两条单链的 切口,带有几个 伸出的核苷酸, 它们之间正好互 补配对,这样的 切口叫黏性末端。

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

SmaⅠ

被限制酶切开 的DNA两条单 链的切口是平 整的,这样的 切口叫平末端。
平末端 平末端

“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
⒈主要来源:
主要从原核生物中分离纯化

⒉种类与命名:
⒊作用特点(特异性)
识别特定核苷酸序列,并且使每条链中特定部 位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

4.限制酶识别序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成

5.作用结果:
产生黏性末端或平末端

生物A基因片段 ……GAATTC…… ……CTTAAG……

生物B基因片段 ……GAATTC…… ……CTTAAG……

EcoRⅠ 酶切
……G AATTC…… ……CTTAA G…… ……G AATTC…… ……CTTAA G…… 不同来源的DNA片段混合 ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG……

如何将不同种来源的DNA片段连接起来?

二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用:
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA,即 将脱氧核糖和磷酸连接起来。

2.作用原理:
催化磷酸二酯键形成

二、DNA连接酶——“分子缝合针”
3.

种类:(1)E· coliDNA连接酶
(2)T4DNA连接酶

两种酶的区别:
类型 来源 功能 相同点 差别

E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端 磷酸 能连接黏性末端和 二酯键 T4DNA连接酶 T4噬菌体 平末端(效率较低)

E· coli DNA连接酶

或T4DNA连接酶

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来,
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”
起来,但效率较低
T4DNA连接酶

? DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
DNA聚合酶 模板 作用底物 DNA连接酶

需要 单个脱氧核苷酸

不需要 DNA分子片段

以一条DNA链为模板, 将DNA双链上的两个 作用特点 将单个核苷酸连接成 缺口同时连接起来, 一条互补的DNA链 不需要模板 相同点 形成磷酸二酯键

三、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
⒈ 运载体必备的条件: ⑴在受体细胞中能自我复制并稳定保存

⑵有1个至多个限制酶切割位点
⑶有特殊的标记基因,便于鉴定和选择 ⑷对受体细胞的生存无决定性作用 ⒉ 常用运载体: ⑴质粒

⑵λ噬菌体的衍生物
⑶动植物病毒

? 常用的载体:质粒
常存在于原核细胞中,是一种裸露的、结构简单、独 立于拟核之外能自我复制的很小的双链环状DNA分子。

有标记基因的 存在,可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别

有切割位点 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制

2 3 4

7 6 8

1

5

思考与探究 P7 (2)
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA? 通过长期的进化,细菌中含有某种限制 酶,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的

识别切割序列,或者通过甲基化酶将甲基转
移到识别序列的碱基上,使限制酶不能将其

切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶也
不会使自身的DNA被切断,并且可以防止外

源DNA的入侵。

思考与探究 P7
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载 体吗?为什么?
不能,作为基因工程使用的载体必需满足以下条件:

1) 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点,以便目的基 因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点 所处的位置,还必须是在质粒本身需要的基因片段之外,这样 才不至于因目的基因的插入而失活。 2) 载体DNA必需具备自我复制的能力,或可整合到受体染色体 DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 3) 载体DNA必需带有标记基因,以便重组后进行重组子的筛选。 4) 载体DNA必需是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入 到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太 大就不便操作。

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条 件,都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗? 迄今为止,所发现的DNA连接酶都不 具有连接单链DNA的能力,至于原因, 现在还不清楚,也许将来会发现可以连 接单链DNA的酶。


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