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基因工程的基本操作程序新


1.2 基因工程的基本操作程序
【问题导引】基因工程的基本操作程序包括哪几个步骤?基因工程的核心步骤是什么?获取目的基因的 方法有哪些?基因表达载体组成及作用?目的基因检测与鉴定有几种方法?

【疑难点拔】 1、【问题导引】为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?cDNA 文库、基因 组文库的区别?反转录法、人工合成目的基因的过

程?利用反转录法得到的目的基因有何特点?PCR 含义、 原理、过程?DNA 复制、PCR 技术与基因克隆有何区别? 1.第一步:目的基因的获取 (1)目的基因的获取方法:①从供体细胞直接获取; ②从基因文库中获取;③利用 mRNA 反转录形成;④ 利用 PCR 扩增技术;⑤人工合成。 (2)基因文库、基因组文库、cDNA 文库的概念及目的 ①基因文库含义:将含有某种生物不同基因的许多 DNA 片段,导入 含有这种生物的 基因文库。 ②分类:基因文库包括基因组文库和 cDNA 文库。① 含有一种生物的 做部分基因文库,如 录而来。 ③建立基因文库的目的:为保存或获得大量的目的基 因作准备,有了基因文库,就可随时从中提取所需要 的目的基因,引入受体细胞使之表达。注意基因文库不是直接保管相应基因,而是保存受体菌(受体菌中含 基因) 受体菌在培养基上以菌落形式存在,每一个菌落都由一个细胞繁殖而来,携带着同种基因,可以利 用目的基因的有关信息,找到目的基因所在菌落,然后再进行提取。可以据基因的核苷酸序列、基因的功 能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 基因组文库的比较 cDNA 文库 基因的基因文库就叫做基因组 基因的基因文库就叫 文库。一般由 mRNA 转 文库。 ②含有一种生物的 的群体中通过克隆而储存, 基因的 群体便构成了

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文库类型 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种之间的基因交流 说明

cDNA 文库

基因组文库

某种生物的部分基因

某种生物的全部基因 部分基因可以

基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目 的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性

注:原核生物的基因结构与真核生物基因结构

(3) 人工合成法: 如果基因片段比较 , 核苷酸序列又已知, 也可以利用 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。

(4))扩增目的基因——PCR ①概念:PCR 是一项在 量扩增目的基因。 ②原理:PCR 是利用 增循环的次数) ③过程:目的基因 DNA 受热变性后解旋形成 用下进行延伸,如此重复循环多次。 1.5 DNA 复制、PCR 技术与基因克隆 项目 场所 DNA 复制 真核生物:细胞核、叶绿体、线粒体 原核生物:细胞质 PCR 扩增技术 生物体外(PCR 扩增仪) 单链, 与单链相应互补序列结合,然后在 作 的原理,条件:已知目的基因的 序列。方式:指数扩增= (n 为扩 复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。通过这一技术,可以在短时间内大

条件 解旋 酶 合成 子链 特点 相同点

模 板 、 ATP 、 四 种 脱 氧 核 苷 酸 、 引 物 链 模板、 四种脱氧核苷酸、 引物链 (DNA 或 RNA 片段) 、 (RNA) 、常温 温度变化(90~95℃→55~60℃→70~75℃)

在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分解开 加热至 90 ℃左右,双链全部解开,不需解旋酶 DNA 聚合酶、解旋酶、DNA 连接酶 热稳定的 DNA 聚合酶(Taq 酶)

在 物 基 上 一 链 续 导 引 的 础 , 条 连 (前 链), 一 链 连分别从两条链的引物端开始,都是连续合成,控制温 另 条 不 续 滞 链 先 成 段 再 ( 后 ), 合 片 , 由DNA连 酶连 度 72℃ 接 接 边解旋边复制,形成的是整个 DNA 分子, 体外迅速扩增,短时间内形成大量目的基因 DNA 片 一个细胞周期只复制一次 段,呈指数增长(2n)

①需提供 DNA 复制的模板②四种脱氧核苷酸作原料③子链延伸的方向都是从 5′端到 3′端

基因克隆:用多种限制性核酸内切酶或机械方法,将某种生物细胞中的 DNA 切成不同片段,并把所有片 段随机地分别连接到用同种内切酶切过的基因运载体上,然后分别转移到适当受体细胞,如细菌中。通过 细菌增殖而构成各个片段的无性繁殖系。 【问题导引】为什么不把目的基因直接导入受体细胞,而是要构建表达载体?基因表达载体的组成包括哪 些?各起什么作用?目的基因与质粒结合形成重组质粒的步骤是怎样的?

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2.第二步:基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基 因能够表达和发挥作用。 (2)组成:目的基因+ + +标记基因+复制原点,插入的目的基因的 表达需要调控序列,因而用作载体的质粒的插入基因部位的上游需有 ,下游 需有 。如图: ①启动子:一段有特殊结构的 别、结合的部位。 ②终止子:一段有特殊结构的 短片段,位于基因的尾端。作用是使 过程停止。 ③启动子(DNA 片段)≠起始密码子(RNA);终止子 有目的基因(目的基因是否导入成功)。 (3)制备重组 DNA 分子: ①将一个基因从 DNA 分子上切割下来,需要 性末端。切割质粒与目的基因一般使用的限制酶通常为 外源 DNA 片段 【特别提醒】如图将含有目的基因的 DNA 与质粒表达载体分别用 EcoRI 酶切,酶切 产物用 DNA 连接酶进行连接后,其中由两个 DNA 片段之间连接形成的产物有目的基 因—载体连接物 、 能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 培养基中,能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 、 目的基因--目的基因连接物三种; 连接物;若接种到含青霉素的 连接物、 连接物 用上述 3 种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中, 个限制酶,同时产生 个黏 酶,这样形成的黏性末端碱基之间互补, (DNA 片段)≠终止密码子(RNA) 片段,位于基因的首端。它是 聚合酶识

④标记基因:一般为抗生素抗性基因或荧光基因等,其作用是鉴别受体细胞中是否含

便于连接。若使用两种不同的限制酶同时处理质粒、外源 DNA 的优点在于可以防止质粒和含目的基因的

【问题导引】转化的含义及实质是什么?农杆菌感染双子叶植物和裸子植物过程是怎样的?农杆菌转化法 为什么不能用于单子叶植物?农杆菌转化法的过程? 将目的基因导入动物细胞的方法是什么?将目的基因 导入动物细胞时,一般为什么采用受精卵作为受体细胞?早期基因工程操作一般都采用细菌等原核细胞作 为受体细胞,其主要原因是什么?在将目的基因导入到细菌细胞时,一般要用 CaCl2 处理,为什么? 3.第三步:将目的基因导入受体细胞 (1)转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (2)转化实质:目的基因整合到受体细胞染色体 组中。 (3)受体细胞:植物可以是卵细胞(受精卵)、体细胞(可经组织培养成为完整植株)。动物只能是受精卵(因 为体细胞的全能性受到严格限制)。微生物常用大肠杆菌、酵母菌等,微生物做受体细胞主要是个体微小, 代谢旺盛,繁殖速度快,获得目的基因产物多。,若要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必需用真核生物酵 母菌,因需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成 熟红细胞,原因是它无细胞核,不能合成蛋白质。目的基因通过运载体导入受体细胞后,有的在细胞核中,有的在细胞质中 (4)三类转化比较 生物种类 常用方法 受体细胞 植物细胞 农杆菌转化法、基因枪法、花粉 管通道法 体细胞、 (卵细胞)受精卵 将目的基因插入 Ti 质粒的 TDNA 转化过程 上→农杆菌→导入植物细胞→整 合到受体细胞的染色体的 DNA 上→稳定维持和表达 (1)农杆菌转化法:①农杆菌特点:易感染 动物细胞 显微注射技术 受精卵 含目的基因表达载体提 纯→取受精卵→显微注 射→受精卵→早期胚胎 培养→胚胎移植→发育 成为新性状的动物


微生物细胞 Ca2 处理法 原核细胞 Ca2 处理大肠杆菌细胞(细胞壁的通透 性增大)→感受态细胞→重组表达载体 DNA分子溶于缓冲液与感受态细胞混合 →感受态细胞吸收 DNA 分子


植物和裸子植物,对________植物没有感染力;Ti 质粒的 3

可转移至受体细胞,并整合到受体细胞的染色体上。 ②转化:目的基因插人

?进入 ? 农杆菌→ ? ?

导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的 基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 ③农杆菌转化法的原理是利用农杆菌(胞内寄生菌)对植 物的感染而把目的基因导入受体细胞。 ④基因工程图解:抗虫棉的培育过程 (2)基因枪法:这种方法是利用压缩气体产生的动力将包裹在 金属颗粒表面的外源 DNA 打入生物组织中。常用的金属颗粒有 金粉粒子或钨粉粒子。一些细胞能像表达自身基因一样表达导入 的外源 DNA。 (3)显微注射法:DNA 可以通过显微注射转入动物细胞中。下 图所示的是目的基因的多份拷贝正通过玻璃微型吸管注射到受 精卵中。转基因小鼠和家畜都是利用这种方法产生的,但是成功 率很低;只有 2%~3%的受精卵发育成转基因动物,在这些动物 只有一小部分表达了转入的基因。 【问题导引】怎样检测转基因生物染色体上是否插入了目的基因?怎样检测目的基因转录出了 mRNA?怎样 检测目的基因是否翻译成蛋白质?以上检测都是在什么水平上的检测?检测的原理分别是什么?如何鉴定 一个抗虫或抗病基因导入棉花细胞后,是否赋予了棉花抗虫或抗病的特性?什么是基因芯片?作用是什 么?工作原理是什么? 4.第四步:目的基因的检测和鉴定 类型 分子 检测 个体水 平检测 步骤 检测内容 方法 结果

1 导入检测 目的基因是否进入受体细胞

DNA 分子杂交(DNA 和 DNA 之间) 是否成功 显示出杂 交带

2 转录检测 目的基因是否转录出信使 RNA 分子杂交技术(DNA 和 RNA 之间) 3 翻译检测 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原-抗体杂交

包括抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品 的活性比较,以确定功能是否相同等。

图例

【特别提醒】 (1)DNA 分子杂交技术首先提取受体细胞中 DNA,然后高温解成单链,再与同位素标记的 DNA 探针杂交; (2)抗原-抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫,产生相应的抗体,并提取出而来的。 (3)基因工程中有 3 种工具,但工具酶只有 2 种;工具酶本质为蛋白质,载体本质为小型 DNA 分子,但不一 定是环状;在整个工程中,只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补配对,其他步骤均发生配对。 (4)要确定抗虫基因导入后,是否能稳定遗传并表达,需进行检测和检定工作,则在个体水平上的鉴定过 程可简述为: 的 物细胞具有 。经筛选分析,该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的 DNA 片段, 培养该技术的原理是植 基因 水平 因此可以把它看作诗杂合子。理论上,该转基因植株自交产生的 F1 代中,仍具有抗虫特性的植株占总数 。导入目的基因的水稻体细胞培养成转基因植株需要利用 ;为确定耐盐转基因水稻是否培育成功,既要用放射性同位素标记的

作探针,进行分子杂交检测,又要用移栽到盐碱地中(或答用一定浓度盐溶液培育、浇灌)方法从 鉴定水稻植株的耐盐性。

(5)外源基因可能随机插入到小鼠受精卵 DNA 中。这种受精卵有的可发育成转基因小鼠,有的却死亡;原因外 源基因插入导致受精卵死亡的最可能原因是外源基因的插入使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达 4

(6)绿色荧光蛋白基因在培育转基因绿色荧光猪时是作为目的基因,进行转基因体细胞的筛选时,比较简 易的筛选方法是通过设备检测,发出明亮的绿色荧光细胞即为转基因体细胞将绿色荧光蛋白基因的片段与 目的基因连接起来组成一个融合基因,再将该融合基因转入真核生物细胞内,表达出的蛋白质就会带有绿 色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 (7)用 32P 标记的胰岛素基因探针,对小鼠胚胎干细胞和胰岛 B 细胞进行检测。 用探针探测细胞的 DNA 胚胎干细胞 胰岛 B 细胞 用探针探测细胞的 RNA 胚胎干细胞 胰岛 B 细胞

表格的空格中应填写的检测结果依次是 (8)基因芯片:基因芯片的测序原理是 DNA 分子杂交测序方法,即通过与一组已知序列 的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。 先在一块基片表面固定序列已知的八核苷酸 的探针,当溶液中带有荧光标记的靶核酸序 列,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生 互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针 位置,获得一组序列完全互补的探针序列。

。 (用“+”表示能检测到,用“-”表示不能检测到) 。 。

从实验结果分析可知,胚胎干细胞分化为胰岛 B 细胞的根本原因是

据此可重组出靶核酸的序列 TATGCAATCTAG(过程见图 1 若靶核酸序列与八核苷酸的探针杂交后,荧光强度 最强的探针位置如图 2 所示,请分析溶液中靶序列为 A.AGCCTAGCTGAA (9) 如图为 DNA 测序仪显示的某真核生物 DNA 片段一条链部分相邻碱基排列顺 序图片。其中图 1 的碱基排列顺序已经解读,其顺序是:GGTTATGCGT。则图 2 中的序列为 (10) DNA 指纹图: 为什么同卵双生的个体会出现相同的指纹?因为同卵双生 的个体是由同一个受精卵发育而成的,所以在正常情况下他们细胞内的遗传物质是相同的。因此同卵双生 的个体会出现相同的指纹;根据 DNA 指纹图来判断罪犯,是由于不同人的 DNA 具有特异性;样品 DNA 切成片段所用的酶是限制性核酸内切酶;DNA 指纹技术的应用亲子鉴定、死者遗骸的鉴定、鉴定不同生物间的亲缘关系等 (11)PCR 技术扩增过程 1.1 变性:当温度上升到 90℃以 上时,双链 DNA 解旋为单链。 1.2 复性: 复性也即退火, 温度下 降到 40~60℃左右, DNA 结合。 1.3 延伸: 温度上升到 72℃左右, 溶液中的四种脱氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下, 根据碱基 互补配对原则合成新的 DNA 链。 1.4 结果:DNA 聚合酶只能特异 地复制处于 引物之间的 DNA 序列, 使两引物之间的固定 长度的 DNA 序列呈指数扩增。 若运用 PCR 扩增目的基因片断,则至少需 次循环复制过程,才可分离出目的基因片段(如图 1 中的 ,第二、三轮中分占 、 , ③④)。据图 1 可知:第一次循环中含引物 A(B)的 DNA 片断占 引物通 过碱基互补配对与两条单链

图1

5

则第 n 次循环中为

。无论循环多少次,需要引物数量为 或引物

,最初的模板双链上没有引物。因 引物。 (图中

此,有两个 DNA 分子分别只含引物 ①②代指引物 A 与引物 B) (12)获取目的基因几种方法的比较 过程 直接 分离

,其余的 DNA 分子都同时含

优点

缺点 专一性较差,分离

用若干个合适的限制酶处理一个 DNA 分子,将它切成若干 个 DNA 片段,然后,将这些不同的 DNA 片段分别与适当 方法操作简便

法(鸟 的载体结合,形成重组 DNA,再将它导入到相应的营养缺 枪法) 陷型细菌中。最后,把这些细菌中的这段 DNA 分离出来 从基 因文 库中 获取 首先把含有目的基因的 mRNA 的多聚核糖体提取 出来,分离出 mRNA,然后以 mRNA 为模板,用 根据目的基因的核苷酸序列、在染色体上的位置、功能、信 使 RNA,以及基因产物的特性等信息获得目的基因

出来的有时并非 一个基因

目的性强、 可操作性强

过程比较繁琐,特 别是 mRNA 很不 稳定、生存时间 短,所以要求的技 术条件较高

反转录法 反转录酶合成一个互补的 DNA,即 cDNA 单链, 专一性强 再以此单链为模板合成出互补链,就成为双链 DNA 分子 人工 合成 基因 据已知的 氨基酸序 列合成

在 DNA 序列分析基础上,当把一个基因的核苷酸 专一性最强、用计算 仅 限 于 合 成 核 苷 序列搞清楚后,可以按图纸先合成一个个含少量 机自动控制的 DNA 酸 对 较 少 的 一 些 (10~15 个)核苷酸的 DNA 片段,再利用碱基对互 合 成 仪 合 成 的 效 率 简单基因,而且必 补的关系使它们形成双链片段, 然后用连接酶把双 高,可以人工合成自 须 事 先 把 它 们 的 链片段逐个按顺序连接起来, 使双链逐渐加长, 然 界 不 存 在 的 新 基 核 苷 酸 序 列 搞 清 最 后得到一个完整的基因 利用 PCR 技术扩增 目的基因 目的基因受热变性解旋→与引物结合→在 DNA 聚 合酶的作用下延伸→单链→碱基互补为双链 因 楚

循 环 往 复 , 指 数 复 条件要求高,在扩 制,可在 PCR 扩增 增 过 程 中 可 能 配 仪中自动完成 对错误

图例

【高考链接】 1.北极比目鱼中有抗冻基因,其编码的抗冻蛋白具有 11 个氨基酸的重复序列,该序列重复次数越多,抗冻

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能力越强,下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图,有关叙述正确的是 A 过程①获取的目的基因, 可用于基因工程和比目鱼基因组测序 B 多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因,不 能得到抗冻性增强的抗冻蛋白, C 过程②构成的重组质粒缺乏标记基因, 需要转入农杆 菌才能进行筛选 D 应用 DNA 探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达 2.家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规 模培养,可以提取干扰素用于制药。 (1)进行转基因操作前,需用_______酶短时处理幼蚕组织,以便获得单个细胞。 (2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达, 需要把来自 cDNA 文库的干扰素基 因片段正确插入表达载体的_________和___________之间。 (3)采用 PCR 技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。改 PCR 反应体系 的主要成分应该包含:扩增缓冲液(含 Mg2+) 、水,4 种脱氧核糖苷酸、模板 DNA、_____________和_________________。 (4)利用生物反应器培养家蚕细胞时,的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器 中,这样可以_________________增加培养的细胞数量,也有利于空气交换。 3.土壤农杆菌是一种能引起双子叶植物产生冠瘿瘤的土壤细菌,它带有一个大的质粒叫 Ti 质粒(含冠瘿瘤 基因),它携带细菌 DNA 向宿主植物基因组转化所需信息的重要片段,只有 T—DNA 片段才转入植物细胞 的基因组。结构及转化过程如图所示,回 答相关问题: (1)若用 Ti 质粒作为抗旱基因的载体, 为了使某种植物具有抗旱性状而又不引起 植物产生冠瘿瘤,需对 Ti 质粒进行修饰, 即 , 将抗旱基因转移至 Ti 质粒的中,且要保证复制起始位点和 不被破坏。然后在一定条件下将外植体在 含有 的土壤农杆菌的稀释培养基上培 形 水 。 养,使得抗旱基因转入植物细胞并整合到植物基因组中。 (2)将上述外植体置于一个含有某种抗生素的合适培养基中进行筛选,发生转化的外植体通过 成愈伤组织,再通过 产生不定芽和体细胞胚再长出整个植物。 (3)基因转化是否成功应对转基因植物进行鉴定,如果培育成的植株能适应干旱环境,还应进行 平鉴定,以确定该变异能否遗传给后代。为获得纯合的转基因植株,还需要对转基因植株进行严格的

4.T-DNA 可能随机插入植物基因组内,导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程 如下:种植野生型拟南芥,待植物形成花蕾时,将地上部分浸入农杆菌(其中的 T-DNA 上带有抗除草剂基 因)悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养,收获种子(称为 T1 代) 。 (1) 为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾, 需要去除 为筛选出已转化的个体, 需将 T1 代播种在含 (3) 为筛选出具有抗盐性状的突变体,需将 T2 代播种在含 与 的抗盐性 植株进行杂交,再自交 代后统计性状分离比。 。 植株的 , 因为后者产生的 会抑制侧芽的生长。 的培养基上生长, 成熟后自交, 收获种子 (称为 T2 代) 。 的培养基上,获得所需个体。

(4)经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突变体。为确定抗盐性状是否由单基因突变引起,需将该突变体 (5)若上述 T-DNA 的插入造成了基因功能丧失,从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物 (6)根据 T-DNA 的已知序列,利用 PCR 技术可以扩增出被插入的基因片段。其过程是:提取

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DNA,用限制酶处理后,再用 D 四种单链 DNA 片断中选取

将获得的 DNA 片段连接成环(如右图)以此为模板,从图中 A、B、C、 作为引物进行扩增,得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。

5.科学家用大肠杆菌进行诱变实验,获得两个营养缺陷型菌株,菌株 A 不能合成甲硫氨酸和生物素,菌株 B 不能合成苏氨酸和亮氨酸,将这两种菌株混合在缺少这四种营养素培养基上,出现了能够生长繁殖的大 肠杆菌,由此推断这两种菌株间实现了基因交流。现代遗传学研究发现,细菌间的基因交流与 F 因子有关, F 因子是一种质粒,含有 F 因子的大肠杆菌(F+)是基因的供体,不含有 F 因子的大肠杆菌(F-)是基因 受体, F+大肠杆菌表有一种称为性菌毛的毛状突起,与 F-大肠杆菌接触时形成接合管,基因交流过程如 下图所示:请回答下列问题: (1)科学家获得两个营养缺陷型菌株的原理 是 ,两个菌株混合,在缺少相应的 。 ,理由是 。 四种营养素的培养基上出现能生长繁殖的新菌 株,这种变异属于 (2)遗传学家将含有 F 因子的基因供体称为父本,不含有 F 因子的基因受体称为母本,细菌间的这种基因 交流行为称为有性生殖,这种遗传现象是否遵循孟德尔的遗传定律? 是 。 。 。 (3)F 因子在细胞中以游离或整合到拟核 DNA 中两种状态存在,F 因子能够整合到拟核 DNA 中的原理 (4)F 因子的单链进入 F- 细菌,F- 细菌变成 F+细菌的原因是 苄青霉素基因,鉴定受体细胞是否含有重组 DNA 的实验思路是 6.请回答基因工程方面的有关问题: (1)利用 PCR 技术扩增目的基因, 其原理与细胞内 DNA 复制 类似(如图 3 所示) 。图中引物为单链 DNA 片段,它是子链 合成延伸的基础。 ①从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物 A 的 DNA 片 段所占的比例为 ②在第 DNA 片段。 (2)设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引 物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图 4) ,请分别说 明理由。 ①第 1 组: ②第 2 组: ; 。 。 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的

(5)在基因工程中,作为目的基因载体的质粒 DNA 分子上有特殊的遗传标记基因,如果标记基因是抗氨

(3)PCR 过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表 2 为根据模板设计的两对引 物序列,图 5 为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度?____ 。

(4) PCR 反应体系中含有热稳定 DNA 聚合酶,下面的表达式不能正确反映 DNA 聚合酶的功能,这是因 为 。

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