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分子遗传(名词解释及简答)


名词、简答(依据 ppt) 一、基因表达调控
1.基因(Gene) 遗传的基本单位,含有编码一种 RNA,大多数情况是编码一种多肽的信息单位; 负载特定遗传信息的 DNA 片段,其结构包括由 DNA 编码序列、非编码调节序列和 内含子组成的 DNA 区域。 2.基因表达(gene expression) 从 DNA 到蛋白质的过程。 对这个过程的调节即为基因表达调控(r

egulation of gene expression)。 3.基因表达的特点 时间特异性——发育阶段特异性 空间特异性——组织细胞特异性 4.基因表达调控的概念 机体各种细胞中含有的相同遗传信息(相同的结构基因),根据机体的不同发育阶段、 不同的组织细胞及不同的功能状态,选择性、程序性地表达特定数量的特定基因的过程。 5.基因表达的方式 1)组成性表达 (constitutive expression):基因较少受环境因素影响,而是在个体各个 生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。如管家基因 ★管家基因(housekeeping gene): 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达。 2)诱导和阻遏表达 诱导表达(induction expression)——在特定环境信号刺激下,基因表现为开放或增 强,表达产物增加。 阻遏表达(repression expression)——在特定环境信号刺激下,基因被抑制,从而使 表达产物减少。 6.基因表达调控的意义 1)以适应环境、维持生长和增殖 2)以维持细胞分化与个体发育 7.原核生物基因表达的调控

8、真核生物基因表达的调控——多层次和复杂性 ★转录前水平:染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA 的甲基化、 组蛋白修饰、染色质结构

★转录水平:转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的, 调控元件主要包括顺式作 用元件和反式作用因子。 ★转录后水平: hnRNA 的选择性加工运输、 mRNA 前体的选择性剪接、 RNA 编辑、 RNAi ★翻译水平:翻译因子的磷酸化调控、mRNA 稳定性调控 ★翻译后水平:蛋白质修饰 简单修饰:乙酰化、甲化和磷酸化 1)基因重排:将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录,这种方 式被称为基因重排。例如,免疫球蛋白结构基因的表达。 2)CpG 岛:在基因组的某些区域中,CpG 序列密度很高,可以达均值的 5 倍以上,成为 鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区, 形成所谓的 CpG 岛。 哺乳类基因组中约存在 4 万个 CG islands, 大多位于基因的启动子区或是第一个外显子区。 3)组蛋白密码(histone code): 组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型组成了组 蛋白密码(histone code) 4)组蛋白修饰种类 ● 乙酰化:大多发生在 H3、H4 的 Lys 残基上,一般与活化的染色质构型相关 ? 甲基化:发生在 H3、H4 的 Lys 和 Asp 残基上,可以与基因抑制有关,也可以与 基因的激活相关,这往往取决于被修饰的位置和程度 ? 磷酸化:发生与 Ser 残基,一般与基因活化相关 ? 泛素化: 一般是 C 端 Lys 修饰,启动基因表达 ? SUMO(一种类泛素蛋白)化: 可稳定异染色质 5)顺式作用元件(cis-acting element) :与受调控基因处在同一染色体(DNA 分子)上的 DNA 序列,能调控该基因的表达。包括:启动子(promoter)增强子(enhancer)沉默子 (silencer)绝缘子(insulator)应答元件(response element) 6)反式作用因子(trans-acting factor) 能与顺式作用元件结合的,调控基因表达的蛋白 : 质或 RNA(tRNA、rRNA 等) 。又称转录激活蛋白(transcription activator) 、DNA 结合蛋 白(DNA binding protein)或转录因子(transcription factor,TF) 7)RNA 编辑: 我们把在 RNA 翻译为蛋白质之前, 通过特殊的机制增减其碱基的数目或对已 有的碱基进行修饰或替换叫做 RNA 编辑 。 8)微小 RNA (microRNA,miRNA):长度约 20~25 个碱基,由一段具有发夹环结构,长度 为 70~90 个碱基的单链 RNA 前体经 Dicer 酶剪切后形成。 9)miRNA 特点: ? 在不同生物体中普遍存在; ? 其序列在不同生物中具有一定的保守性; ? 具有明显的表达阶段特异性和组织特异性。 10)小干扰 RNA (small interfering RNA, siRNA):是细胞内一类双链 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在特定情况下通过一定酶切机制,转变为具有特定长度(21~23 个碱基)和特 定序列的小片段 RNA。 11) RNAi: siRNA 介导的基因表达抑制作用是转录后基因沉默 由 (post-transcriptional gene silencing,PTGS) 被称为 RNAi。 siRNA 和 miRNA 的差异比较:

二、疾病基因的定位与克隆
基因定位的基础——遗传标记、连锁与重组、致病基因(变异)的直接鉴定 1.遗传标记(genetic marker) :用连锁分析法进行基因定位时需要的一些已知遗传位点,这 些位点按孟德尔方式遗传,具有多态性,本身并不致病,这些位点称为遗传标记(genetic marker) 。 2. DNA 多态性:在人群中,某一基因座上存在两种或两种以上的基因型,较少一种基因型 出现的频率不低于 1%,就称 DNA 多态性。 ? 限制性内切酶片段长度多态性(RFLP) ? 重复序列拷贝数多态性(STR) ? 单核苷酸多态性(SNP) ? 拷贝数多态性 (CNP) 3.连锁分析(linkage analysis):利用被定位的基因与同一染色体上另一遗传座位(多态性位 点)相连锁的特点,将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。 ? Lod 值≥3 表示肯定连锁 ? Lod 值≤-2 表示否定连锁 ? Lod 值介于 +1 和 +3 之间,支持连锁 ? Lod 值介于 - 2 和 +1 之间,不支持连锁 4. 重组(recombination):同源染色体之间 DNA 的交换,常发生于减数分裂时。 重组值(recombination fraction):是基因定位时两个基因座间遗传图距的量度,即基因间 的遗传距离。 5.cM 是遗传距离的基本单位 ? 1cM 代表重组值为 1%, 即两个基因座在减数分裂时发生重组的概率为 1%, 1cM 约等于 1Mb。 ? 重组值的最大取值为 50%,意即两个距离 50cM 的基因座之间是不连锁传 递的,就像分别在不同的染色体上一样。 6.连锁分析实例 第一步就是要确定所有家系成员基因组中多态性遗传标记的基因型 第二部确定连锁的最大区域(define the maximal region of linkage) 第三部找致病基因和错义突变(pathogenic mutation) 检测区域内候选基因或着对所有基因进行 DNA 测序 7.致病基因/变异的直接鉴定 ? 原位杂交 荧光原位杂交(FISH) ? 比较基因组杂交(CGH) ? 全基因组(全外显子组)测序 8、为什么研究单基因病? 1)解释基因的功能 ? 单基因遗传病是研究基因与人类疾病关系的最好的、不可替代的自然疾病模型。 ? 采用小鼠遗传病模型研究基因的功能有许多局限。 2)发现新的遗传机制 ? 单亲二体 uniparental disomy ? 遗传印记 parental imprinting ? 上位效应 epistatic interaction

? 表观遗传 epigenetics ? 三核苷酸扩增 trinucleotide repeat expansion 3)研究复杂的疾病模式 ? 遗传异质性与表型异质性 ? 表型复杂性:表型不一致的同卵双生子 ? 同一个基因突变产生似复杂疾病的连续表型 4) 为复杂疾病的研究提供线索 ? APC 基因:遗传性直肠癌——其它直肠癌 ? BRCA1 基因:家族性乳腺癌——其它乳腺癌 ? APOA1, LCAT 基因 ? 低胆固醇血症:单基因病型——多基因病 5)为遗传病分子诊断奠定基础 ? 单基因遗传病诊断 ? 出生缺陷筛查 ? 遗传病预防 ? 个体化治疗指导 9、疾病基因定位与克隆策略

10、定位克隆(positional clone) ——适用于孟德尔遗传单基因疾病

四要素: 家系 遗传标记 连锁分析与基因定位 基因变异发掘及功能研究

11.复杂遗传病

12、遗传分析方法; 参数分析(模型依赖)——复合分离分析、连锁分析 非参数分析(非模型依赖)——受累同胞(亲属)对连锁分析 、连锁不平衡分析

关联研究——就是连锁不平衡分析 A 分类: ? 群体为基础的关联研究病例-对照研究 疾病人群 (cases) 和对照人群 (controls). 比较两组人群中基因和基因型频率 ? 家系为基础的关联研究 传递不平衡检验 (TDT) 收集患者及其父母的资料 比较患者及其父母的基因传递信息. B 肯定存在遗传标记与疾病关联的现象可归纳为两类:一种是致病基因位点与遗传标记位 点存在很强的连锁不平衡;另一种是遗传标记位点本身与疾病发生相关。 C 不足之处:

13.SNP 单体型(haplotype) 人类基因组中,相邻近的 SNPs 等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。位于一条染色体上 或某一区域的一组相关联的 SNP 等位位点被称作单体型( haplotype) 14.小结:

三、多基因病
1.数量性状 (Quantitative trait) 性状的变异是连续的,相对性状存在着一系列的过渡型,个体间仅存在有数量或程度上的 不同,无类型或本质的差别,决定数量性状的基因座为数量性状基因座 (QTL, quantitative trait locus) 。 质量性状 (Qualitative Trait ) 性状的变异在群体中的分是不连续的,称为质量性状。例如人类的白化病、豌豆植株的高 矮等 2. 多基因遗传 ( Polygenetic Inheritance ) 指生物和人类的许多表型性状由不同座位的较多基因协同决定,而非单一基因的作用,因 而呈现数量变化的特征,故又称为数量性状遗传 3. 微效基因(Minor Gene ) : 在多基因遗传中,每对基因对性状的效应是微小的,故称为微效基因;但是不同的微效基 因可以通过累加作用而形成一个明显的表型性状,所以又称为累加基因 ( Additive Gene ) 4. 多因子遗传(Multifactorial inheritance ) 多基因遗传性状除受微效累加基因的作用外,还受环境因素的影响,因而是两种因素共同 作用形成的一种性状,因此,这种遗传方式又称为多因子遗传 ★数量性状遗传特点 ? 多基因作用的微效性 ? 变异的连续性 ? 分布的正态性 ? 对环境的敏感性

5.易患性(liability) 在多基因遗传病中,遗传基础和环境因素的共同作用,决定一个个体患病可能性的大小, 称易患性 6. 遗传率(h2) 多基因病中,易患性的高低受遗传基础和环境因素的双重影响,其中遗传基 础所起作用的大小称为遗传率(h2) (heritability)。 7.多基因病的遗传特点 ? 包括一些常见病和常见的畸形,发病率大多超过 1/1000 ? 发病有家族聚集倾向 ? 发病率有种族(或民族)差异 ? 患者双亲、同胞、子女亲缘系数相同,发病风险相同 ? 随着亲属级别降低,发病风险迅速下降 ? 近亲婚配,子女发病风险增高,但不如 AR 显著 8.多基因病遗传研究方法(结合二、11-14) 识别某种疾病病遗传因素的作用强弱 ↓ 选择研究方法 ↓ 家系材料:参数分析 散在人群:非参数分析、关联分析 小鼠:杂交分析、基因敲除 9.复杂疾病遗传学研究的意义 ? 疾病机制(干预靶点) ? 治疗应答 ? 预警预测

四 表观遗传学—1
1.

2.表观遗传的特点

3. (结合一、8)

4.表观遗传现象

五 表观遗传——DNA 甲基化和组蛋白乙酰化
1. DNA 甲基化:在 DNA 甲基转移酶 (DNA methyltransferase, DNMTs) 的作用下,将一个 甲基添加到胞嘧啶的 5’-碳分子上,形成 5-甲基化胞嘧啶 (5-methylcytosine) ; 2. DNA 甲基化的分布: – (1)转座子 – (2) 逆转录病毒衍生的重复序列 – (3) 大多数功能基因的编码区 3.DNA 甲基化的检测 ? 1. 传统实验方法

– Methylation-sensitive restriction enzymes – Methylation-specific enzyme McrBC ? 2. 现代方法 – MeDIP: methylated DNA immunoprecipitation assay – MBD:methylation binding domain ? 3. DNA 甲基化位点的确定:Bisulfite genomic sequencing 4.DNA 甲基化的功能 宿主防御模型 (The Host Defence Model) 基因调控模型 (The Gene Regulation Model) 5.组蛋白的乙酰化 ? 1. 通常发生在蛋白质的赖氨酸(K)上; ? 2. 可逆的生化反应: – A. Histone acetyltransferase,HAT (>30) – B. Histone deacetylase, HDAC (18) ? 3. 分子效应:中和赖氨酸上的正电荷,增加组蛋白与 DNA 的排斥力 ? 4. 生物学功能: – A. 基因转录活化 – B. DNA 损伤修复

六 表观遗传——染色质的结构
1. 染色质重塑 Chromatin Remodeling:遗传信息表达、复制和重组过程中,染色质的包装 状态,核小体中的组蛋白以及对应的 DNA 分子会发生改变的分子机理。 2.染色体重塑的当前认识 ? 1. 两类酶调控染色质重塑的过程:组蛋白修饰因子 (histone modifiers) 以及 ATP 依赖的染色质重塑因子 (chromatin remodelers) ? 2.组蛋白修饰因子并不改变核小体的位置, 而是在 DNA 上作标记, 以招募其他的活 性成分 (组蛋白密码) ? 3.染色质重塑因子:水解 ATP 释放能量,从而改变染色质的结构

七 遗传重组
1.突变(mutation) ? 基因组中小段区域内核苷酸序列的改变, 如替换、缺失、插入 ? 突变效应:同义突变、错义突变、终止突变、连读突变 2.重组遗传重组(Genetic Recombination) ? 指遗传物质的交换和重排,其共有特征是 DNA 双螺旋之间的遗传物质发生交换 ? 同源重组、位点专一性重组、转座、异常重组 1)同源性重组(Homologous recombination) ? 依赖大范围的 DNA 同源序列联会,重组过程中两个 DNA 大片段交换对等的部分 ? 蛋白质因子对 DNA 序列的特异性要求不高;存在重组热点和序列长度的影响 ? 真核生物染色质的状态影响重组的频率 ? 发生于减数分裂时同源染色体非姐妹单体交换;细菌的转化、转导、结合;噬菌体 的重组等

条件: ? 在交换区具有相同或相似的序列 ? 双链 DNA 分子间互补碱基进行配对 ? DNA 分子断裂 ? 重组酶 ? 异源双链区的形成 模型: ? Holliday 双链侵入模型 ? Meselson-Radding 单链侵入模型(见基因Ⅷ) ? 双链断裂修复模型(见基因Ⅷ) 同源性重组的应用: ? 基因打靶 、转基因、基因 knock-out 技术、重组工程 重组步骤 同源 DNA 联会及链侵入 大肠杆菌 RecA 和 SSB 真核细胞 Rad51, Dmc1(减数分裂)

引入双链断裂 作用于 DNA 断裂端以产 生侵入的单链 Holliday junction 组装



Spo11(减数分裂期) MRX 蛋白(Rad50/58 核酸 酶) Rad52、 Rad59 蛋白

RecBCD:解旋酶/ 核酸酶 RecBCD RecFoR RuvA,RuvB 和

Holliday junction 识别和分支移位 Holliday junction 拆分

未知 可能是 Mus81 或其它

RuvC

2)位点特异性重组(Site-special recombination) ? 是由整合酶催化,在两个 DNA 序列的特异位点间发生的重组 作用: ? 参与表达的调节 ? 发育过程中程序性的 DNA 重排 ? 有些病毒或者质粒复制循环过程中发生的整合与切除等等 3)转座重组(Transposition) ? 一段 DNA 序列不依赖序列的同源性从染色体的一个部位转移到同一染色体或其 它染色体的另一个部位。这种可移动的 DNA 片段称为可动基因(mobile gene) ,转 座元件或转座因子(transposable element)

八 基因与个性化医疗
1.SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : 即单核苷酸多态性, 是人类基因组中最常见的基因多态性, 是继 RFLP, STR 之后的第

3 代遗传学标记, 是个体差异的最基本因素,是功能基因组学、 疾病基因组学、药物基因 组学和环境基因组学研究重要内容。 2.药物遗传学(pharmacogenetics) : 研究由于遗传背景的不同导致其对药物反应差异的学科称为药物遗传学。 研究群体间遗传变异所导致的药物反应的差异,通过研究遗传因素对药物代谢动力学 的影响,重点研究与药物副作用相关的基因及其表达。 3.Pharmacogenomics(药物基因组学) 是更为广义的概念,是在整个基因组层面上研究药物反应的差异;还包含将人类基 因组学的技术(如基因序列分析、大规模的基因表达分析和生物信息学)用于临床药物的 开发和试验,其目的是为了检测、诊断和治疗导致疾病的遗传因素。 4.如何检测药物的遗传因素 基因转录组水平、基因转录组水平、基因组水平(多态性)、基因突变 5.多药耐药性(MDR)是指肿瘤细胞对一种抗癌药物耐药的同时,对其它结构和机制不同 的药物也产生耐药性。

九 遗传工程小鼠与医学研究
1.为人为改造某些遗传性状,将外源基因或改造修饰的内源基因导入小鼠受精卵,产生携带此 基因的小鼠品系,并能通过生殖细胞将其传递给后代的小鼠,称为遗传工程小鼠 2.真核细胞 DNA 转移技术 ? 磷酸钙沉淀 ? 脂质体输送 ? 显微注射 ? 电穿孔 3. 阳性选择:额外基因之一(neoR)赋予其新霉素抗性,它允许对细胞的阳性选择,无论 发生的是同源(特定)还是非同源(随机)重组 阴性选择: 第二个额外基因,由单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因( tkHSV)赋予对 gancyclovir 一种细胞毒性核苷酸类似物) ( 的敏感性, 该基因允许对发生非同源重组的 ESCs 进行阴性选择,只有经历同源重组(如外源 DNA 对基因靶向特异性插入)的 ESCs 才能在 这种选择中存活下来 4. 分类: ? Transgenics——转基因小鼠携带已随机整合到宿主基因组的克隆基因,大多数情况 下,这种技术不会导致内源性基因被置换,而是其额外拷贝的整合、 ? Knockout Mice——基因敲除小鼠是一种基因工程小鼠,向正常个体内引入某个突 变等位基因而选择性地使某特定基因功能失活,可培养出靶向性剔除某基因的小 鼠,而导致行为特性改变。 ? Knockin Mice——Knockin 是在染色体特定基因座上靶向引入经改造的内源基因 (以基因突变为主),改变小鼠原有基因的表达,但是不破坏原有基因的结构完整性, 只改变该基因的功能。 ? Knockdown Mice——为一种新的遗传工程小鼠, 特色为身上所带有的 RNAi 会降低 或停止目标基因的表达,达到稳定的“gene knockdown”目的。 5.人类疾病动物模型分类 ? 按产生原因分类: ? 自发性动物模型(spontaneous animal model)

? 诱发性动物模型(induced animal model) ? 遗传工程动物模型(genetically engineering animal model) ? 按系统范围分类 ? 疾病的基本病理过程:炎症,肿瘤,休克 ? 各系统疾病动物模型:心血管、呼吸、消化、职业病 ? 按模型种类分类 ? 整体动物、离体器官和组织、细胞株等

十 CNV
1.拷贝数目变异:CNV 人类基因组中广泛存在的,从 1000bp 到 3Mb 范围内的缺失、插入、 重复和复杂多位点的变异。 2.机制: – NAHR 非等位同源重组 – NHEJ 非同源末端连接 – FoSTeS 复制叉停滞和模板转换 – L1 retrotransposition L1 介导的逆转录转座 3.

4.CNV 特征 可遗传性、相对稳定性、 高度异质性 5.CNV 关联分析 全基因组 候选区域 罕见 CNV 尚有三场讲座

文献综述
一.结合疾病基因的定位和克隆知识 1 Clinical, neuroimaging and neuropathological features of a new chromosome 9p-linked FTD-ALS family——基因定位 ★重点,读懂系谱图, Results——Genome-wide linkage analysis and identi?cation of minimal linked region ——Mutation analysis of candidate genes Discussion——首段 ——Re?ned localisation of the chromosome 9p FTD-ALS associated region 2 Expanded GGGGCC Hexanucleotide Repeat in Noncoding Region of C9ORF72 Cause Chromosome 9p-Linked FTD and ALS——基因鉴定 ★基本都要看

二.此为李新哲同学译文

全基因组失功能筛选表明蛋白酶体在 HDAC 抑制剂诱导的凋亡中起重要作用 摘要: 异常乙酰化作用与肿瘤发生密切相关, 靶向组蛋白去乙酰化酶(HDACs)对乙酰化进行调 节作为一种可行的治疗策略正在跨步发展。通过全基因组范围失能筛选鉴定的 HR23B,可 以将泛素化的载物蛋白运输至蛋白酶体,它是 HDAC 抑制剂诱导凋亡敏感性的一个决定因 素。HR23B 也可以控制肿瘤细胞对直接作用于蛋白酶体的药物的敏感性。HR23B 的水平影 响了肿瘤细胞对 HDAC 抑制剂的反应,HR23B 在原位皮肤 T 细胞淋巴瘤中高水平表达,此 类恶性肿瘤对基于 HDAC 的治疗反应良好。这些结果提示蛋白酶体活性促进了 HDAC 抑制 剂的抗癌活性。 引言: 异常的表观遗传调控是恶性表型获得的一个重要决定因素, 这一共识使得发展以调控表 观遗传通路为基础的药物来治疗肿瘤成为一项积极的研究。 在表观遗传调控机制中, 可逆的 组蛋白乙酰化是一个关键基础。从抗癌制剂角度来说,进展最迅速的领域之一即是小分子 HDAC 抑制剂。从基于细胞的实验来看,HDAC 抑制剂对肿瘤细胞增殖有显著作用,可以 广泛促进凋亡的发生。因此,HDAC 抑制剂已经进入临床研究。尽管临床前景不可预测, 而且基于 HDAC 抑制剂的治疗很复杂,但当前很多类型的肿瘤对于此治疗反应良好。血液 恶性肿瘤尤其敏感,在这一方面,伏地诺他(SAHA)已经在晚期皮肤 T 细胞淋巴瘤中展示了 希望性的临床效果。 然而,HDAC 抑制剂如何发挥抗肿瘤活性,HDAC 抑制剂通过哪些关键机制和通路来 阻滞肿瘤细胞增殖尚存疑问。 尽管解除对染色质的控制很可能与杀肿瘤细胞有关, 但是很多 其他促进 HDAC 抑制剂细胞效应的机制和通路也有报道。而且,阐明控制杀肿瘤细胞的关 键通路对搞清相应肿瘤的临床范围有帮助,后者大部分仍未明确。

正是在这种大背景下我们设计了一种全基因组失功能筛选来鉴别那些控制肿瘤细胞对 HDAC 抑制剂敏感性的基因。我们推测通过筛选鉴定出的基因可能为研究 HDAC 抑制剂作 用的细胞通路和分子机制指明方向。结果得出了涉及到蛋白酶体尤其是有关 HR23B 的蛋白 酶体靶向活性的一条重要功能通路和蛋白酶体在 HDAC 抑制剂诱导凋亡中的潜在作用。 HR23B 的水平影响了 HDAC 抑制剂处理的结果, 蛋白酶体活性通过一条在 HDAC 抑制剂处 理细胞中涉及到 HR23B 的通路被解除调控。我们的研究表明异常蛋白酶体活性促进了 HDAC 抑制剂的抗肿瘤活性,为鉴别出可以从基于 HDAC 抑制剂的治疗中临床获益的病人 提供了一个合理的基础。 结果: (1) HDAC 抑制剂敏感型基因的失功能筛选 失功能筛选使用了一个可以靶向涉及大量人类癌症基因的 shRNA 文库, 在这一文库中, 延长处理时每个 shRNA 都可以强烈而特异性地诱导基因表达抑制。我们将筛选成型,使之 可以鉴定影响 U2OS 细胞对 HDAC 抑制剂敏感性的基因。 这一基本原理基于这样一个事实: HDAC 抑制剂诱导凋亡所必须的沉默基因可以使细胞在药物存在的情况下存活。可以分离 存活的细胞,鉴定相关基因,在功能性分析中证实作为 HDAC 抑制剂敏感性的决定因素; 筛选的结果(图 1A)。 我们将焦点聚集在一个靶向 HR23B 的 shRNA 载体,它赋予了 U2OS 细胞对 HDAC 抑 制剂诱导凋亡的耐受。 为了证实被 shRNA 序列命中的基因表达是否降低, 我们研究了 HR23B 蛋白的水平。HR23B 蛋白水平在稳定表达 HR23B 特异性 shRNA 的细胞中很低(图 1B)。从 稳定表达细胞获取的 shRNA 序列的作用被用来和一个命中相同序列(SP)的 siRNA 以及另外 一个来自于不同 HR23BRNA 区域的 siRNA(2)比较; 两种 siRNA 均可以耗尽 HR23B(图 1C)。 核纤层 siRNA 作为一种非相关基因特异性地控制 siRNA。 为了证实 HR23B 在调控肿瘤细胞对 HDAC 抑制剂敏感性中的作用,我们使用两种 HR23BsiRNAs 对 HDAC 抑制剂诱导的凋亡进行干扰,从而评估去 HR23B 的效果。导入任 一个抗 HR23BRNA 的 siRNA,包括 SPsiRNA,都可以降低 U2OS 细胞对 HDAC 抑制剂处 理后凋亡反应的敏感性(图 1D)。此外,来源于 HR23B 敲除小鼠的鼠胚胎成纤维细胞(MEFs) 比野生型对照对 HDAC 抑制剂诱导的凋亡更加不敏感(图 1E)。HR23B 是两个人类酿酒酵母 Rad23 的同系物之一。 然而, HR23AsiRNA 并不影响 HDAC 抑制剂诱导的凋亡(图 1F 和 1G), 提示 HR23A 和 HR23B 在细 HDAC 抑制剂诱导的凋亡中发挥了不同的作用。 已经认识到 HR23B 在调控肿瘤细胞对 HDAC 抑制剂敏感性中发挥了重要功能, 接下来 就要评估 HDAC 抑制剂对于 HR23B 的作用。在用 HDAC 抑制剂 SAHA 处理的 U2OS 细胞 中 HR23B 水平升高,它在 HR23B 免疫染色中显示了更高水平。在用 HDAC 抑制剂处理的 多种其他细胞中也观察到了 HR23B 的升高,包括 A2780(卵巢),MCF7(乳腺),H460(肺)肿瘤 细胞(图 S2A)。其他 HDAC 抑制剂,包括 PXD101 和 VPA(丙戊酸),连同天然产物曲古抑菌 素 A(TSA),对 HR23B 均有相同的作用,但对 RNA 水平没有明显作用(图 2C 和 2D)。而且, HR23B 是乙酰化了的,48h 后在未处理和处理的细胞中都发生了乙酰化作用 (图 2E 和 2F), 处理 24h 后乙酰化作用适度增强(图 S2B)。所以,HR23B 是依靠乙酰化机制来靶向作用的, 它在 HDAC 抑制剂处理的细胞种是通过转录后机制进行调控的。 然而,评估其他种类尤其是那些也通过诱导凋亡来杀肿瘤细胞的制剂对于 HR23B 的调 控作用也是很重要的,这可以排除 HR23B 是被药物诱导的凋亡普遍影响的这一可能性。在 凋亡诱导环境下用不同抗肿瘤制剂,包括依托泊苷,博来霉素,阿霉素,紫外灯处理的细胞 中(图 S2C),对 HR23B 水平影响甚微(图 2G 和 2H)。 (2) HR23B 在 HDAC 抑制剂处理的细胞中的作用

HR23B 参加了 NER(核苷酸剪切修复),它与着色性干皮病互补蛋白(XPC)结合,然后后 者与损伤的 DNA 互相作用。 它还有另一个重要的作用: 将泛素化的底物靶向到蛋白酶体上。 定位在 HR23B N 末端区域的泛素样结构域与蛋白酶体相互作用,定位于中间部分和 C 末端 区域的两个泛素相关结构域使 HR23B 将要降解的蛋白运输到蛋白酶体。为了更加明确 HR23B 与 HDAC 抑制剂敏感性相关的特性,我们研究了 HDAC 抑制剂对于 XP4PA 细胞的 作用。 XP4PA 细胞 XPC 基因缺陷, NER 活性较低, 所以, 在这些细胞中 HR23B 对于 NER 的重要性降低了。然而,XP4PA 细胞与对照组人类 M2C5 成纤维细胞及 U2OS 细胞一样, 对于 HDAC 抑制剂诱导的凋亡敏感。对照组的两类细胞正常表达 XPC 和 NER 活性(图 3A 和 3Ba), 当用 HDAC 抑制剂处理后, U2OS 和 M2C5 细胞相比, 与 类似地 HR23B 在 XP4PA 细胞中被诱导。这些结果表明 HDAC 抑制剂并不是通过依赖于 NER 活性的 HR23B 依赖性 通路来诱导凋亡。 (3) HDAC 抑制剂处理细胞中蛋白酶体活性 为了检验 HDAC 抑制剂是否影响 HR23B 和蛋白酶体的相互作用,我们研究了 HR23B 和蛋白酶体之间的联系。HR23B 经由泛素样结构域与蛋白酶体交互作用,可以靶向运输蛋 白到蛋白酶体。当免疫沉淀反应抗体是抗 HR23B(4 倍,图 3Ca)时, HDAC 抑制剂处理的 细胞中结合到蛋白酶体的 HR23B 水平升高, 当免疫沉淀反应抗体识别 20S 核心 alpha6 亚基 (4 倍,图 3Cb)时,HR23B 同样升高。当用 HDAC 处理后,可以观察到 HR23B 和 S5a19S 蛋白酶体亚基的相互作用加强。因此,在 HDAC 抑制剂处理细胞的中 HR23B 与蛋白酶体的 联系增强。 为了证实蛋白酶体活性在 HDAC 抑制剂处理细胞中是异常的,我们使用了可以表达不 稳定 GFP(GFPu)的 HEK293 细胞系,在这种细胞中 GFP 被融合到 Ch1 降解子序列。Ch1 序 列通过泛素-蛋白酶体途径将其靶向到降解状态,使 GFP 不稳定。GFP 水平独立地代表了蛋 白酶体活性程度。与预期一样,GFPu 在蛋白酶体抑制剂波替单抗存在的情况下是稳定的(图 3D),证明 GFPu 的水平反映了蛋白酶体降解蛋白的能力。一旦滴定了不同 HDAC 抑制剂 (TSA,SAHA,PXD101),与对照组处理相关的 GFPu 蛋白水平明显升高(图 3E)。而且,并 非改变的 RNA 水平导致 GFPu 水平的升高 (图 3F)。 我们接下来评估 HDAC 抑制剂对于在体蛋白酶体活性的影响。从未处理细胞得来的纯 化蛋白酶体没有直接被 HDAC 抑制剂影响,这与波替单抗的效果相反,后者可以拮抗蛋白 酶体活性(图 3Ga)。然而,从 HDAC 抑制剂处理细胞纯化而来的蛋白酶体降解蛋白活性下降 了(图 3Gb),这与从 GFPuHEK293 细胞系得来的结果是一致的(图 3E),即在 HDAC 抑制剂 处理细胞中蛋白酶体活性打了折扣。 为了研究 HR23B 对蛋白酶体活性的效应(HDAC 抑制剂依赖性的), 我们将 HR23BsiRNA 导入 GFPu1HEK293 细胞系,以 GFPu 水平来监控其作用。一旦去 HR23B,HDAC 抑制剂 处理的细胞中增强的 GFPu 水平即降低(图 3H)。所以结果表明在 HDAC 抑制剂处理的细胞 中 HR23B 阻碍了 GFPu 的降解。由于 GFPu 通过蛋白酶体来降解(图 3D),所以水平降低的 HR23B 在 HDAC 抑制剂处理细胞中恢复了蛋白酶体活性。 蛋白酶体日渐被公认为可行的癌症靶标, 很多种类的干扰蛋白酶体活性的小分子药物或 已经批准用于临床或在研发中。与 HDAC 抑制剂的方式相似,蛋白酶体抑制剂在肿瘤细胞 造成了广泛的凋亡。 由于 HR23B 很可能是造成 HDAC 抑制剂处理细胞中蛋白酶体活性改变 的原因,我们猜测 HR23B 也可能影响细胞对于蛋白酶体抑制剂的敏感性。的确,在 U2OS 细胞中 HR23BsiRNA 将蛋白酶体抑制剂 MG132 诱导的凋亡水平显著降低(图 4A-4C)。 此外, 一旦用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理 U2OS 细胞,HR23B 即被诱导(图 2G,图 4C),达到与 用 HADC 抑制剂处理的细胞中观察到的相似水平。 所以 HR23B 在介导肿瘤细胞对于 HADC 抑制剂和蛋白酶体抑制剂药物的敏感性上发挥重要功能,表明 HADC 和蛋白酶体通路有交

叉。 (4) 临床 CTCL 活检中 HR23B 的表达 尽管在临床上哪种肿瘤对于 HADC 抑制剂有良好反应还是未知的,但血液恶性肿瘤皮 肤 T 细胞淋巴瘤(CTCL)对基于 HADC 抑制剂的治疗特别敏感。我们评估来源于血液恶性肿 瘤的肿瘤细胞系中 HR23B 的水平,然后评价其对 HDAC 抑制剂的敏感性。在来源于 CTCL 和多发性骨髓瘤(MM)的细胞系中,HR23B 水平与细胞对 SAHA 的敏感性相关(图 4D,图 S2F)。依此,从患有 CTCL 的病人身上获得的临床活检中检测 HR23B 水平就很有意思。通 过对活检证实了的 CTCL, 包括蕈样真菌病和它的白血病突变型 Sezary 综合征进行免疫组化 检测,HR23B 高表达(表 1)。HR23B 的表达定位于恶性 CD3 阳性 T 细胞和肿瘤群区域(图 5)。由于某些 CTCL 活检表达低水平的 HR23B(表 1),故 HR23B 高表达并非 CTCL 的普遍 特征。 而且, 在存在活化 T 细胞的良性组织例如慢性皮炎中 HR23B 是低水平的(根据抗 CD3 染色)(表 1,图 6A),所以 HR23B 的表达并非活化 T 细胞的一个标志。CTCL 代表了对基于 HADC 抑制剂的治疗敏感的一类恶性肿瘤,HR23B 在原位 CTCL 恶性 T 细胞中被高表达。 讨论 (1) 蛋白酶体和 HDAC 抑制剂 最初认为 HDACs 是一个主要通过调控组蛋白乙酰化从而作用于表观遗传水平的酶家 族,所以 HDAC 抑制剂可以通过影响表观遗传调控来杀细胞。然而,很多种类的非组蛋白 和非染色质相关蛋白已被发现可以进行乙酰化, 故目前认为乙酰化是一个涉及转录后水平修 饰的多效作用,而并非仅仅与表观遗传特别相关。我们的研究影响了 HDAC 抑制剂杀肿瘤 细胞的机制。许多机制例如死亡受体的上调,对血管生成的影响,对细胞周期监测点的调控 等可以解释 HDAC 抑制剂诱导的细胞死亡。本研究结果提高了异常的蛋白酶体活性促进杀 细胞过程的可能性,用全基因组失功能筛选法挑选那些决定 HDAC 抑制剂诱导凋亡敏感性 的基因中鉴定出的 HR23B 在介导 HDAC 抑制剂发挥效应中起到重要的功能作用。 HR23B 去 尤其降低了肿瘤细胞对 HDAC 抑制剂所致凋亡的敏感性。HR23B 可以将运载蛋白运输到蛋 白酶体并参与 NER,我们的研究表明蛋白酶体运输活性在 HDAC 抑制剂处理细胞中才是重 要功能的那个。与此观点一致,在 HDAC 抑制剂处理的细胞中,HR23B 和蛋白酶体之间的 联系增加了,蛋白酶体的活性打了折扣。重要的是,HR23B 的水平对蛋白酶体介导的蛋白 质周转有着直接影响, 因为去 HR23B 可以在 HADC 抑制剂处理的细胞中恢复蛋白酶体活性。 故在 HDAC 抑制剂处理的细胞中涉及 HR23B 的机制调控蛋白酶体活性(图 6B)。 尽管这些结 果并未排除其他可促进 HDAC 抑制剂诱导死亡的机制或者通路, 但确实提示了 HR23B 和蛋 白酶体是在 HDAC 抑制剂处理细胞中受到异常调控的通路的成分。 (2) HDAC 抑制剂的临床应用 除了影响 HDAC 抑制剂处理的细胞,HR23B 控制着肿瘤细胞对直接作用于蛋白酶体类 药物的敏感性。这一现象很有趣,它支持了这一观点:HDAC 抑制剂影响了蛋白酶体的活 性, HDAC 和蛋白酶体抑制剂通过交叉机制诱导了凋亡。尤其后点可以在临床中发挥重要 作用,因为在临床要经常使用联合治疗以求最大效果。在一个涉及 HDAC 和蛋白酶体抑制 剂的治疗中, 药物剂量和使用时序的精妙平衡对于达到能够介导抗肿瘤活性的必要蛋白酶体 抑制水平可能是必需的。 尽管有很多假设,HDAC 抑制剂通过哪些机制在 CTCL 中发挥抗肿瘤活性仍未知。因 此,CTCL 是唯一类非常规地对 HDAC 抑制剂敏感的恶性肿瘤还是代表着仍需证明其敏感 性的恶性肿瘤之一尚存疑问。 由于 2 期概念验证临床研究成为可行的, 使得评估这一重要问 题也将变为可行。然而,临床实验是漫长的,同样重要的是,在没有可利用的生物标记情况 下进行调查来预测肿瘤对于的治疗的反应是一项挑战性工作。 如果可以鉴别出可预测模式的

生物标志,就很可能加速我们对反应性肿瘤临床范围的认识。 总之, 我们使用了全基因组失功能筛选方法来探寻 HDAC 抑制剂诱导细胞死亡的机制。 本研究开辟了一条方法路径,它与 HDAC 抑制剂处理细胞中改变的蛋白酶体活性和 HR23B 的蛋白酶体靶向活性相关。这个结果指明了可以应用蛋白酶体(可以促进基于 HDAC 抑制剂 治疗的抗肿瘤活性)进行水平的控制管理。


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