当前位置:首页 >> 农学 >> 细胞生物学讲课课件

细胞生物学讲课课件


7.5 程序性细胞死亡

讲授内容
一、概述 二、细胞凋亡的生物学特征 三、细胞凋亡过程与调控 四、细胞凋亡的发生机制 五、细胞凋亡与疾病

学习要求
? 掌握细胞凋亡的概念、生物学意义。 ? 掌握细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的 差别。 ? 熟悉细胞凋亡的主要变化。 ? 熟悉细胞凋亡的调控。 ? 熟悉细胞凋亡与常见疾病的关系。 ? 了解细胞凋亡在疾病防治中的意义。

一、概述
细胞的生长、增殖、分化和死亡是细胞的4 大特点,细胞死亡分为细胞凋亡和细胞坏死。

细胞凋亡是细胞主动的,在基因严格调控下 的细胞“自杀”行为,也称为细胞程序性死亡 (programmed cell death, PCD),与细胞坏死 不同。

细胞凋亡:细胞在一定的生理或病理条 件下,遵循自身的程序,结束其生命的生理 性死亡,是受基因严格调控的细胞自杀现 象.凋亡过程中,细胞骨架蛋白分解—细胞 和细胞器浓缩而不裂解—染色体DNA断裂和 形成凋亡小体—细胞内含物不外泄,不引 起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识 别和吞噬。

细胞坏死(necrosis)是在各种致病 因素(如缺氧、物理、化学和生物学因素) 的剧烈刺激下的病理性死亡。 其特点是: 引起死亡的因素剧烈,死 亡迅速。能量代谢下降—膜通透性增加— 细胞水肿—细胞器破裂,细胞溶解,DNA 不断裂—内含物释放—引起炎症反应。

1

细胞凋亡与坏死的比较

1.性质 2.诱导因素 3.生化特点 4.形态变化 5.炎症反应

细胞凋亡与坏死的区别 —————————————————— 坏死 凋亡 — ———————————————————
病理性,非特异性 强烈刺激,随机发生 被动过程,无新蛋白 合成,不耗能 细胞结构全面溶解、 破坏、细胞肿胀 溶酶体破裂,局部 炎症反应 弥散性降解,电泳 呈均一DNA片状 无 无

生理性或病理性,特异性 较弱刺激,非随机发生

主动过程,有新蛋白合成, 耗能 胞膜及细胞器相对完整细 胞皱缩,核固缩 溶酶体相对完整,局部无炎 症反应 DNA片段化(185bp),电泳 呈“梯”状条带 有 有

6.DNA电泳

7.凋亡小体
8.基因调控

———————————————————

衰老的概念(附)
是生命过程 的必然
可结合保健 防病加以控 制
?现代人类面临着3种衰老:

心理负担 和压力

生理性衰老

病理性衰老; 心理性衰老

; ?衰老(senescing,aging):是机体在退化时期生理功能下降 和紊乱的综合表现,是不可逆的生命过程。
?人的衰老与细胞的衰老相关联。

Hayflick界限
1961年,Hayflick 首次报道了体外培养的人的成纤维细胞 具有增殖分裂的极限。 细胞来源 胚胎成纤维 细胞 成人成 纤维细胞 20 老年人成 纤维细胞 2-4

传代数目

50

细胞,至少是培养的二倍体细胞,不是不死的, 而是有一定的寿命;它们的增殖能力不是无限的, 而是有一定的界限,这就是 Hayflick界限

**。

请注意观察老人 的外部形态特征

个体衰老与细胞衰老

老人会出现 皱纹、老人色斑、白头发

衰老症状
皮肤干燥、发皱 头发变白 老人斑 饮食减少

原因分析
细胞水分减少,体积减小 细胞内的酶活性降低 细胞内色素的累积 细胞膜通透性功能改变

早老症儿童与正常儿童的比较

细胞衰老特征:
1、细胞内水分减少; 2、有些酶的活性降低;

3、细胞内的色素逐渐积累;
4、细胞呼吸减慢,核增大, 染色质固缩,染色加深; 5、细胞膜透性改变,运输功能降低。

细胞的凋亡

? 由基因所决定的细胞自动结束生命的过程, 就叫细胞凋亡 ? 细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序 性调控,所以也常常叫做细胞编程性死亡

? 2002年,英国科学家悉尼· 布雷诺尔、约 翰· 苏尔斯顿和美国科学家罗伯特· 霍维茨。 他们为研究器官发育和程序性细胞死亡过 程中的基因调节作用作出了重大贡献。

? Sydney Brenner

H. Robert Horvitz

JohnE.Sulston

细胞凋亡
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 叶子的离开 不是风的追求 也不是树的不挽留 而是命运的安排 自然的选择 该来的会来 该走的会走 有时候离开 并不意味着结束 而是-另一种开始!

细胞的凋亡是一种自然的生 理过程,由基因决定的细胞 自动结束生命的过程。

发生在我们身边的细胞凋亡 有哪些?

蝌蚪在变态发育过程中的尾消失 人胎儿指趾的形成 被病原体感染的细胞的清除 ……

发生在我们身边的细胞凋亡

二、细胞凋亡的生物学特征
? ? ? ? (一)细胞凋亡的形态学特征 (二)细胞凋亡的生化特征 (三)细胞凋亡的生理意义 (四)细胞凋亡的检测方法

(一)细胞凋亡的形态学特征
? 细胞:首先变圆,体积缩小,与邻近细胞的连 接丧失,失去微绒毛,胞浆浓缩。 ? 细胞核的变化:胞核内染色质浓缩形成密集颗 粒呈帽状〈或新月形),位于核被膜下。核被膜 下核纤层(nuclear lamina)分解,随后细胞核 内染色质固缩为不均一点状结构。 ? 细胞质和细胞膜:相邻细胞间连接复合体普遍 消失,其他细胞膜特有结构如微绒毛等亦随之 消失。此时,细胞膜结构仍保持完整。

? 细胞器:

线粒体:保持完整呈正常状态
溶酶体:保持完整,内容物不外泄

形成凋亡小体: 内质网、高尔基复合体及核被膜膨大,
形成泡状结构与细胞膜融合,以出泡方式离开正在死 亡的细胞,将所包含的完整细胞器和核碎片等细胞内

容物以细胞质膜包被成凋亡小体(apoptosis bodies)
释放到细胞外。凋亡小体之间在体积上差异很大,与 细胞产生的凋亡小体数目和细胞的大小有关。凋亡小 体很快被周围邻近间质细胞或巨噬细胞吞噬,而不引 起周围组织的炎症反应。

凋亡细胞的形态学特征:

空泡化

固缩

出芽

边集

凋亡小体

(二)细胞凋亡的生化特征:
①胞浆内Ca2+浓度升高。 ②细胞内活性氧增多。 ③质膜通透性变大。 ④ DNA片段化形成梯状条带。DNA内切酶 活性被激活升高,双链DNA在核小体之间 切断形成~185bp为基数的有序片段。 ⑤Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶 (Calpain)活性升高。

DNA的片段化断裂 蛋白质的降解

典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳(呈现梯状条带)

核酸内切酶活化与DNA电泳呈梯子状改变是
Apoptosis的生物化学标志。

核酸内切酶在核小体连接处将DNA链切断,
从而最终产生寡聚核小体。这些寡聚核小体的大

小均是DNA长度为180 - 200个碱基对(bp)的倍数,
因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNA时出现特征

性的“梯状”(ladder)带纹。

(三)细胞凋亡的生理意义
1

维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡:清 除衰老损伤的细胞:皮肤、粘膜细胞的更新等。 2 在胚胎发育中起重要作用 a 手指和脚趾的形成等。 b 大脑神经元之间形成 连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。 c 在淋巴 细胞发育成熟中起重要作用。d 心脏发育过程中左 右心室、房的形成以及左右心室的厚度,通过细胞 凋亡调节。 3 细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病。

(四)细胞凋亡的检测方法
◆形态学观测:染色法、透射和扫描电镜观察

◆DNA电泳:DNA片段就呈现出梯状条带
◆TUNEL测定法:即DNA断裂的原位末端标记法

◆彗星电泳法(comet assay)
◆流式细胞分析
根据凋亡细胞DNA断裂和丢失,采用碘化丙啶使DNA
产生激发荧光,用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞,同时又能观察细胞的周期状态。

一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许 多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1、光学显微镜和倒置显微镜 (1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜 完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴 壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 (2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细 胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块 状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2、 DNA电泳
形成大小为180~200bp整倍性的DNA 梯状条带;

细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA 电泳图
1.细胞色素c诱导0 h 2.细胞色素c诱导1 h 3.细胞色素c诱导2 h 4.细胞色素c诱导3 h 5.细胞色素c诱导4 h 6.阴性对照 7.Marker

3、TUNEL测定法
即DNA断裂的原位末端标记法:凋亡细胞核中DNA产生 3’-OH末端,可用原位缺口翻译或末端标记法显示凋亡细 胞。

4、彗星电泳法
凋亡细胞形成的DNA降解片段,在电场中泳动速度快,使 细胞核产生彗星式的图案;

5、流式细胞分析
根据凋亡细胞DNA断裂和丢失,采用碘化丙啶使DNA产生

激发荧光,用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞。

三、细胞凋亡过程与调控
? (一)、细胞凋亡的过程(四个阶段) ? 1.凋亡信号转导 ? 2.凋亡基因激活 ? 3.凋亡的执行(由DNase 和caspases执 行) ? 4.凋亡细胞的清除。

凋亡诱导因素 +
受体 cAMP Ca2+ 神经酰胺 死亡信号 信 号 转 导 Dnase激活 Caspases激活

细胞膜

凋亡相关 基因激活

细胞核

凋亡过程Ⅰ

Caspases激活 Dnase激活 执行凋亡 凋亡细胞的清除

凋亡过程Ⅱ

凋亡 cAMP 诱导 +受体 Ca2+ 因素 信号转导 神经酰胺

死 亡 信 号

Dnase激活 Caspases激活 执行凋亡

凋亡相关基因激活 基因激活 巨噬细胞吞噬 分解凋亡细胞

凋亡过程小结

凋亡细胞的清除

凋亡过程及分期
凋 亡 诱 导 因 素
诱导期 期
凋 亡 相 关 基 因 激 活

受 体

cAMP Ca2+ 神 经 酰 胺

死 亡 信 号

Dnase 激活 Capases 激活

巨噬细胞 吞噬细胞 凋亡细胞

执行期

消亡

(二)、细胞凋亡的调控
? 1.细胞凋亡的诱导因素与抑制因素 ? (1)诱导因素(启动细胞凋亡) ? 激素和生长因子失衡:二者过多或缺 乏均可应起细胞凋亡。例:强烈应激反应 糖皮质激素 淋巴细胞凋亡。

? 理化因素:电离辐射、高温、强酸、强碱、 细胞毒性抗癌药等。 ? 免疫性因素:免疫细胞在生长、分化及执 行防御、自稳、监视功能中,其免疫分子参 与 免疫细胞或靶细胞的凋亡过程。 ? 微生物因素:细菌、病毒 及其毒素 可诱 导细胞调亡。如HIV可至 CD4+, T淋巴 细胞凋亡 ,是爱滋病的发病机理。

(2)抑制因素(抑制细胞凋亡) 细胞生长因子:如IL-2 、神经生长因子。 激素 例:ACTH 肾上腺皮质细胞增 生
抑制细胞凋亡

2、细胞凋亡信号的转导
凋亡诱导因素
作用于

细胞

转化为

凋亡信号

胞内信号转导途径

激活细胞死亡程序

细胞凋亡(DNA片段化及蛋白解体)。

死亡受体通路:
诱导信号+配体

线粒体通路:
缺氧、缺血、酸中毒等原因

诱导信号+配体+衔接蛋白

线粒体膜通透性下降

诱导信号+配体(如Fas)
+衔接蛋白+Procaspase-8 (死亡诱导信号复合物)

凋亡启动因子释放
(cyt-c、Apaf-1等)

cyt-c + Apaf-1 + Procaspase-9 Procaspase-8激活为 Caspase-8

Procaspase-9激活为Caspase-9

3.细胞凋亡的相关基因

(1)抑制凋亡基因:Bcl-2(B 细胞淋巴瘤 \白血病-2基因)。 Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia -2)基 因: 分布:造血细胞、上皮细胞、淋巴细 胞、多种瘤细胞。

功能:抑制多种凋亡诱导因素(如电离辐射、化学药物)
所引起的细胞凋亡 ( 细胞 增殖)。 机制: *直接抗氧化而抑制细胞调亡; *抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质; *抑制凋亡蛋白酶的激活; *维持细胞钙稳态。

(2)促进凋亡基因: 野生型p53基因——编码p53蛋白,故名。 功能:促使恶性肿瘤细胞、衰老细胞或损伤较重的 细胞凋亡,修复受损的细胞(分子警察)。 机制:射线、毒素 启动DNA修复机制 启动细胞凋亡机制 DNA损伤+P53 蛋白 DNA修复 细胞凋亡

P53 基因突变后反而抑制细胞凋亡,值得注意。

(3)双向调控基因:C.myc

双向调节:
诱导细胞增殖(有生长因子)

诱导细胞凋亡(无生长因子)

四、细胞凋亡发生机制
(一)氧化损伤
(二)钙稳态失衡 (三) 线粒体损伤 (四)细胞凋亡的分子机制

(一)氧化损伤

? ? ? ? ? ? ?

氧化应激与自由基的损伤作用 1.氧自由基攻击细胞膜上不饱和脂肪酸,引起脂质过 氧化直接造成细胞膜损伤,导致细胞凋亡。 2. 氧化应激可激活Ca2+/Mg2+ 依赖的核酸内切酶及活 化核转录因子如NF-kB,诱导细胞凋亡。 3.氧化应激引起细胞膜结构的破坏,使Ca2+ 内流增加 诱导细胞凋亡。 4.激 活P53基因,细胞调亡。

(二) 钙稳态失衡
? 1.激活Ca2+ / Mg2+ 依赖的核酸内切酶,降解 DNA链; ? 2.激活谷氨酰胺转移酶,使细胞骨架蛋白分子 间发生广泛交联,有利于凋亡小体形成。 ? 3.激活核转录因子,加速细胞凋亡相关基因的转 录; ? 4.Ca2+ 在ATP的配合下使DNA链舒展,暴露 出核小体之间的连接区内的酶切位点,有利 DNA内切酶切割DNA。

(三)线粒体损伤
? 1.线粒体 损失,导致ATP不足,线线体膜通透 感性增高Ca2+浓度升高, 均可启动细胞凋亡。 2.膜电位下降,线粒体膜转换孔开放,通透性增 加,细胞凋亡因子被激活,使细胞色素C,凋亡 蛋白酶激活因子,凋亡诱导因子释放到细胞浆。 1)细胞色素C+凋亡蛋白酶激活因子,激活 Caspase-9,导致细胞凋亡。 2) 凋亡诱导因子激活核酸内切酶,增强 Caspase-3活性导致蛋白水解。
?

(四)细胞凋亡的分子机制
●线虫(C.elegans)
●Caspase家族与凋亡 ●Bcl-2家族与细胞凋亡

●细胞凋亡的分子机理

1 线虫(C.elegans)
细胞凋亡受基因控制。线虫是研究

细胞凋亡分子基础的理想材料。
每条线虫具有1090个细胞,其中

在正常情况下有131个细胞在发育过
程中以凋亡的方式死亡。从线虫中找

到若干控制细胞凋亡的基因。

找到一系列与细胞凋亡有关的基因
ced-3、ced-4 诱发、启动,促进细胞凋亡 ced-9 基因阻止ced3/ced4的激活,抑制凋亡

① ced-3、ced-4 基因突变或缺失,
使凋亡受阻

② 移入 ced-9
③ 失去 ced-9

使凋亡受阻
使细胞凋亡

2 Caspase家族与凋亡
◆ Caspase家族
◆ Caspase激活 ◆ Caspase水解的靶蛋白

Ced3的哺乳类同源基因是ICE(Interleukin-1- converting enzyme), 即 Caspase-1。

Ced4的哺乳类同源基因是Apaf-1(细胞凋亡蛋白活化因子)。
Ced9的哺乳类同源基因是BCL-2。

Caspase家族是一组与众不同的蛋白水解酶,在凋亡早期阶 段被激活,并负责引发随后的凋亡变化,通过切割一组高度 选择性的必须蛋白质来实现这一功能。
Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine) 裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键

因此称为Cysteine aspartic acic specific protease,即 Caspase

Caspase激活
细胞中合成的Caspase自身以无活性的酶 原状态(Procaspase)存在,经激活后方能执 行其功能。
其激活依赖于其他的 Caspase在它的天冬 氨酸位点水解活化或自身活化

胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径
◆上游启始者Caspases切割、活化下游执行者Caspases
当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后,凋亡细胞表面信号分子受体 相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合,这些衔接蛋白 又募集Procaspases聚集在受体部位,Procaspase相互活化并产生级联 反 应,使细胞凋亡

◆下游执行者Caspases活化后,水解蛋白底物,启动凋亡
裂解核纤层蛋白,导致细胞核形成凋亡小体; 裂解DNase结合蛋白,使DNase释放,降解DNA形成DNA Ladder; 裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白,使凋亡细胞皱缩、脱落, 便 于细胞吞噬; 导致膜脂PS重排,便于吞噬细胞识别并吞噬。

3 Bcl-2家族与细胞凋亡
◆Bcl-2
是一种原癌基因,是ced-9在哺乳类中的同源物,能抑制细胞凋 亡;与线粒体及内质网膜相结合;Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿 膜的结构域;Bcl-2家族成员的基因中,常常含有三个保守的

Bcl-2同源区,即BH1,BH2和BH3

◆Bcl-2蛋白质家族成员以不同的方式调节细胞凋亡
促进凋亡: Bad、Bid、Bax 阻止凋亡: Bel-X 、Bel-w、 Bel-2

◆哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC

五、细胞凋亡与疾病
正常机体细胞生长与死亡的平衡

生长 正常机体

坏死、凋亡

细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与疾病的关系—— 该“死”的 细胞不死,不该“死”的细胞却死了,也就是 说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的 发生。 ? 细胞凋亡不足:肿瘤,自身免疫病,

? ?

细胞凋亡过度:心肌缺血,心力衰竭,神 经元退行性疾病,病毒感染 不足与过度并存:动脉粥样硬化

凋 亡 相 对 不 足

肿瘤、自身免疫性疾病、 病毒感染等

(一)细胞凋亡不足
1.肿瘤 细胞增殖过度、细胞凋亡不足。 实验研究:

P53基因(促凋亡基因)缺失或突变
Bcl-2基因(抑制凋亡基因)表达过度 临床应用:

细胞凋亡不足

肿瘤

放疗、化疗

诱导瘤细胞凋亡

? 2.自身免疫病 ? 机体对自身抗原发生免疫应答——自身组 织损伤。 ? 针对自身抗原免疫细胞凋亡不足 ——自身 免疫病。 ? 例: 1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发 性硬化症、慢性甲状腺炎。 ? 临床应用:糖皮质激素 ——诱导自身免疫 性淋巴细胞凋亡。

细胞凋亡过度

神经退行性疾病、造血衰 竭性疾病、 心肌缺血/再灌注损伤

? (二)细胞凋亡过度 ? 1.心血管疾病 (1)急性心肌梗死,坏死与凋亡同时存在

(2)心力衰竭

与心肌细胞功能异常及凋亡有关
实验研究: 心肌细胞肥大 压力负荷 心肌细胞凋亡 心力衰竭

临床新思路:
阻断心肌细胞凋亡,预防心力衰竭。 2.神经元退行性疾病 Alzheimer disease, AD; Parkinson disease ;肌萎缩性侧索硬 化症等。

AD病理特点: 脑实质内β-淀粉状蛋白沉积,脑萎缩。 AD发病机制:

凋亡诱导因素(氧自由基)
编码β-淀粉状蛋白基因 元 凋亡。 临床应用: 尼莫地平(钙拮抗剂)

神经元Ca2+内流
β-淀粉状蛋白合成

激活
神经

降低细胞内[Ca2+]

VitE(抗氧化剂)

清除氧自由基

减缓神经元凋亡

(三)细胞凋亡不足与过度并存 动脉粥样硬化症 (内皮细胞凋亡过度,平滑肌细胞

增殖>凋亡)

细胞凋亡不足与过度并存
氧化型LDL 血小板激活 AgⅡ 高血压 内皮细胞凋亡过度 平滑肌凋亡不足

动脉粥样硬化

三 、 研究细胞死亡的意义
对细胞死亡的研究,有利于疾病机制的 阐明,探索疾病的治疗方法。有重要的临床

意义。

能力有限 努力无限! 你的建议是我前进的动力! 欢迎大家提出意见和建议!


更多相关文档:

细胞生物学课件内容

细胞生物学课件内容_理学_高等教育_教育专区。细胞生物学 第一章 绪论 一、细胞生物学研究的内容与现状 (一)细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科 生命体是多...

细胞生物学课件

课件整理而来课件整理而来隐藏>> 生物体形态结构和生命活动的基本单位. 从细胞、亚细胞和分子三个水平上研究细胞生命活动的科学。 第二节 细胞生物学的发展简史大致...

最新版南开大学细胞生物学课件

以及生物学现象的分子生物学过 生物大分子结构与功能的关系, 程; 3) 生物大分子在细胞成分中的组织结构方式,以及活细胞在合成大 生物大分子在细胞成分中的组织...

细胞生物学课件内容-2011

细胞生物学课件内容-2011 隐藏>> 细胞生物学 第一章 绪论 一、细胞生物学研究的内容与现状 (一)细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科 生命体是多层次、非线...

细胞生物学PPT课后习题

细胞生物学PPT课后习题_理学_高等教育_教育专区。细胞生物学课后习题 第一章细胞生物学绪论 名词解释: 细胞学:细胞学是研究细胞的形态、结构和功能以及与细胞生长、...

细胞生物学课件

细胞生物学课件 隐藏>> 第一章 绪论一、 细胞生物学研究的对象和内容 细胞是所有生物体最基本的结构和功能单位 b, 是由膜围成的能独立进行生长繁殖的原 生质...

细胞生物学课件

细胞生物学课件10 32页 免费细​胞​生​物​学​课​件 ...教学总结精品范文 小学五年级英语教学工作总结 大学教师个人工作总结 小学英语教学...

细胞生物学格式教案

教学 讲授、讨论 方法 CAI 课件 和手段: 4 主要 (详细内容见课件) 教学一、细胞生物学研究的对象、目的和任务 内容二、细胞生物学发展简史 及教三、细胞生物学...

武汉大学细胞生物学课件

武汉大学细胞生物学课件 隐藏>> 第一章绪论第一节细胞生物学的研究内容和概况 一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科 1、什么是细胞生物学(cell biology)?...

西华师范大学细胞生物学课件总结

细胞生物学课件总结,伍老师的课件(西华师大)细胞生物学课件总结,伍老师的课件(西华师大)隐藏>> 第六章教学目的 核糖体与核酶 核糖体与核酶 1、 掌握真核细胞和...
更多相关标签:
网站地图

文档资料共享网 nexoncn.com copyright ©right 2010-2020。
文档资料共享网内容来自网络,如有侵犯请联系客服。email:zhit325@126.com