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电泳技术和常用电泳仪(二)教学单元教案


湘 潭 职 业 技 术 学 院

教 学 单 元 教 案
课程
仪器分析

任课教师

张诺

201 2 授课类型 及时数 执行时间





学期
学时 学时 学时

授课题目 授课班



电泳技术和常用电泳仪(二)
11 检验 301.302 班

√理论课: 2 □实践课: □理实一体化:

3 月 27

日 ~





教 学 目 标

了解电 泳 技 术 的 分 类 ;电泳仪临床应用实例; 熟悉电泳方法简介; 掌握毛细管电泳分离模式;与毛细管电泳相关的基本概念;电泳技术的质量控制。

教 学 重 点 与 难 点 教 学 方 法 和 手 段 参 考 资 料

重点:毛细管电泳的特点;影响电泳的外界因素。 难点:电泳技术的质量控制。

多媒体教学

陶义训,吴文俊主编 《现代医学检验仪器》 上海科学技术出版社,2002 陶义训主编 《现代检验仪器导论》 上海科学技术出版社,2002 曾照芳主编 《临床检验仪器学》 第 2 版 人民卫生出版社,2005 朱根娣主编 《临床常用检验仪器原理、构造、维护》 上海科学技术文献出版社,2002





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教 学 单 元 教 案
教学内容及过程
教学引入:电泳是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移 动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术。 教学内容:





5 毛细管电泳的基本结构和分离模式 5.1 与毛细管电泳相关的基本概念 电场强度、 电泳淌度、迁移时间、电泳速度、电渗流、焦耳热。 5.2 基本工作原理 溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力,沿毛细管通道,以不同速度向 与其所带电荷相反的电极方向迁移,并依据样品中各组分之间淌度和分配行 为上的差异而实现分离。 5.3 毛细管电泳的特点 高灵敏度、高速度、高分辨率、样品少、易自动化、应用范围广。 5.4 毛细管电泳分离模式 毛细管电泳有多种分离模式,如毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、 毛细管凝胶电泳、等电聚焦毛细管电泳、毛细管等速电泳和毛细管电色谱等。 5.4.1 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)也称为毛细管 自由溶液区带电泳,根据组分的迁移时间进行定性,根据电泳峰的峰面积或 峰高进行定量分析。它适用于小离子、小分子、肽类、蛋白质的分离,在一 定限度内适合于 DNA 的分离。应用 CZE 分离人血清中氨甲喋呤(MTX)及其代 谢产物 7–羟基氨甲喋呤(7–OH–MTX) 。 5.4.2 毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。适 用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA 类物质的分离。CGE 正在向第二代 DNA 序 列测定仪发展,并将在人类基因组计划中起重要作用。 5.4.3 毛细管胶束电动色谱 毛细管胶束电动色谱又称微团电动毛细管层析,该技术的最大特点是使 毛细管电泳有可能在用于离子型化合物分离的同时进行中性物质的分离,加 强了毛细管电泳的选择项,弥补了中性分子分离方向的不足。因此在各个领 域特别是生物药物领域显示了广泛的应用前景。 5.4.4 毛细管等电聚焦电泳 毛细管等电聚焦电泳是在电场作用下,带电的分子会在电解质中作定向 的迁移,毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程,具有极高的 分辨率, 通常可以分离等电点差异小于 0.01pH 单位的两种蛋白质, 例如肽类、 蛋白质的分离。 5.4.5 毛细管等速电泳 毛细管等速电泳是一种较早采用的模式,是电泳中唯一的分离组分与电 解质一起向前移动的同时进行分离的电泳方法。常用于分离小离子、小分子、 肽类及蛋白质。

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5.4.6 毛细管电色谱 毛细管电色谱它包含了电泳和色谱两种机制,是在毛细管中填充或在毛 细管壁上键合(或涂壁)固定相,从而构成毛细管色谱柱,依靠电渗流推动 流动相,携带样品迁移,根据样品分子的质荷比、分子尺寸及分配系数的差 别而分离。它与色谱法的不同在于,流动相通道色谱柱的推动力是电场力, 而不是压力。它与区带毛细管电泳法的区别是具有电泳与色谱二种作用力, 因此适用范围更广泛。 5.5 毛细管电泳仪的基本结构 毛细管电泳仪的结构并不复杂,主要有高压源、毛细管柱、检测器,以 及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液槽。输出讯号和记录装 置相连,记录装置可以是一个普通的记录仪、积分仪,也可以是有控制功能 的计算机工作站。图 6-4 是毛细管电泳仪装置示意图。

毛细管电泳仪装置示意图 5.5.1 毛细管柱 毛细管是毛细管电泳仪的核心部件,毛细管电泳的分离过程主要在毛细 管内完成。毛细管柱通常都是圆管型的,理想的毛细管柱应是化学和电惰性 的,紫外和可见光可以透过,易于弯曲,有一定的柔性,耐用而且便宜。 5.5.2 检测器 5.5.3 毛细管电泳法的进样技术 5.6 常用各种电泳仪简介 稳压稳流电泳仪、全自动乙纤膜电泳仪、全自动荧光/可见光双系统电泳 仪、全自动琼脂糖电泳仪、双向电泳及双向电泳-液相色谱-质谱联用、高效毛 细管电泳及高效毛细管电泳-质谱联用、毛细管电泳芯片、DNA 测序系统 6 电泳仪临床应用 6.1 血清蛋白电泳 血清中的蛋白质构成了血清溶解物的绝大部分,其中有载体蛋白质、抗 体、酶、酶抑制剂、凝血因子。新鲜血清经乙酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染 色后,通常可见5条带,即清蛋白、?1、?2、?和?球蛋白。 6.2 尿蛋白电泳 临床进行尿蛋白电泳的主要目的是:①确定尿蛋白的来源;②了解肾脏 病变的严重程度(选择性蛋白尿与非选择性蛋白尿) ,从而有助于诊断和预后 的判断。 6.3 血红蛋白及糖化血红蛋白电泳 应用电泳法鉴别患者血液中 Hb 的类型及含量, 对于贫血类型的临床诊断 及治疗具有重大意义。 6.4 免疫固定电泳

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可对各类 Ig 及其轻链进行分型, 最常用于临床常规 M 蛋白的分型与鉴定。 6.5 同工酶电泳 6.6 脂蛋白电泳 脂蛋白电泳检测各种脂蛋白(包括胆固醇和甘油三酯)主要用于高脂血 症的分型、冠心病危险性估计,以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发 展、诊断和治疗(包括治疗性生活方式改变、饮食及调脂药物治疗)效果观 察的研究等。 7 电泳技术的质量控制 7.1 电泳分析前的质量控制 电泳分析前的质量控制是指电泳操作前所可能存在或出现的误差以致影 响电泳的结果,包括选择标本采集、标本保存、电泳方法、电泳试剂保存等。 7.2 电泳分析中的质量控制 7.3 电泳分析后的质量控制 三、电泳技术新进展 一、电泳技术与免疫技术相结合,大大扩大了其临床应用的范围 让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向、从而加快了沉淀反 应速度。免疫电泳技术的种类很多,如:对流免疫电泳(CIEP) 、火箭免疫电 泳(RIE) 、电免疫扩散(EID) 。该技术的最大优势是敏感性达 50-150mg/dl, 操作周期短,分辨率高,结果易于分析。现最常用于 M 蛋白的分型与鉴定, 已列入临床实验室的常规检测工。 二、电泳技术进行同工酶谱分析,提高诊断率 1.血清乳酸脱氢酶同工酶(ISO -LDH) :测定 LDH 同工酶有电泳法、离 子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法,但迄今用得取多的仍是琼脂 糖凝胶电泳法。经电泳分离后要分离出五种同工酶区带,急性心肌梗塞发病 后平均 6h LDH1 即开始升高,LDH1/LDH2≥1 为心肌损伤的阳性决定性水平, 肝癌时可见 LDH5 明显升高,各区带含量的确定,将经电泳分离后的同工酶 谱采用扫描予以定量,其精确度明显高于用肉眼判断。 2.血清肌酸激酶同工酶(ISO-CK) ;测定 CK 和 CK-MB 仍是目前用于 证实急性心肌梗塞的首选指标。近年来国内一些单位用免疫抑制法测 CK-MB,使用电泳方法分离 CK-MB,是根据 CK-同工酶分子结构不同,在电 泳缓冲液中,所带电荷各异,可以从阴极到阳极将 CK 不同组份予以分离, 其分别为 CK-MM,CK-MB 和 CK-BB。电泳特点是当出现异常同工酶如巨 CKⅠ、巨 CKⅡ等,从电泳图谱上很容易发现,由扫描仪对各条酶进行扫描, 报告各条区带所占百分比,结合总酶活力,求得区带的酶活力定值结果。 Macro-CK 在 CK-MM 和 CK-MB 中间, CK-MT 位置靠近阴极端, CK-MM 而 在 后面。这样不会将 CK-BB 和各种异常同工酶误认为是 CK-MB 而误诊,也可 解决 CK-MB 假性增高的错误原因所在。为此,CK 同工酶电泳是项非常实用 的检验技术,具有十分重要的临床意义。 3.CK 亚型同工酶:此外,CK-MB 和 CK-MM 亚型测定常采用琼脂糖凝 胶等电聚焦电泳或高压电泳,由于操作比一般电泳麻烦,故常规常测定尚无 法普及。目前引进的自动电泳仪,有试剂盒提供,可作 CK 亚型分析,参考 值 : CK-MM1 ( 57.7± 4.7 ) %;CK-MM2 为 (26.5± 5.3);CK-MM3 为 (15.8± 2.5)%;CK-MM3/CK-MM1 比值为 0.28± 0.05(范围 0.15-0.39),阳性决定性 水平>0.5。AMI 第一天血中以 MM3 为主,但第二天以后则以 MM1 为主。采 用电泳法分离 CKMB,CKMB1 和 CKMB2 在正常人血中 CK-MB2 极微,一 般比值近似 1,在急性心肌梗塞后 4-6h CKMB2 亚型即在血循环中可被检测

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到,故 MB2/MB1 的比例明显升高,并早于总 CK-MB 片段的增高。当心肌梗 塞缓解后此比值也逐渐下降。也可用于溶栓治疗后的病情观察。 三、结合酶免疫标记抗体技术,检测脑脊液内寡克隆区带 曾有作者报道采用二维电泳和银染进行 CSF 蛋白质的分离与鉴定,方法 繁复,耗时,现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离 CSF 中的蛋白质,并经抗 原和辣根过氧化物酶标记的特异性 IgG 抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带” (OCB) ,经此酶免疫标记放大技术和显色步骤,蛋白质浓度达 31-125ul/L 即 可予以检测,可使检测灵敏度提高了 100 倍,这样脑脊液无须浓缩,避免了 在浓缩过程中蛋白质的丢失。可用于证实和分辨 OCB 免疫球蛋白及其型别。 若在脑脊液标本中检出 OCB,而其相应标本中未能检出区带,则为阳性,真 实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白,具有重要临床意义。它 是一种定性检测,在多发性硬化症时,OCB 是一个十分重要的标志物。但须 将患者血清和 CSF 在同一天同步进行分析,以认证不同来源的免疫球蛋白。 中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号,主要用于诊断和 鉴别诊断中枢神经系统疾患如:多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、神经性梅素 等。 四、利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白(a) ,用于心、脑血管独立的危 险因子的检测 该该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。血清经 琼脂糖凝胶电泳,再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。由于凝胶中脂蛋白 等电点不同,不仅可区分 a、前 β 和 β 区带,又因介质中含有抗脂蛋白(a) [LP(a)]抗体及阳离子存在,抗 LP(a)与患者血清中 LP(a)结合形成复 合物,阳离子则抑制其他脂蛋白的泳动速度,LP(a)便与其他脂蛋白分离开 来,使分辨十分清晰的 LP(a)条带呈现在前 β 与 γ 区域之间,将阳性条带扫 描后,可获得区带的面积及其百分含量,该方法使电泳技术趋于完美,大大 减少了手工操作的弊端,既可予以半定量,又能将胶片保存,便于比较。提 高对心、脑血管独立的危险因子--LP(a)检测的敏感性和特异性。 五、按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳,区分尿蛋白类型 尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型,可在无损 伤的情况下, 协助临床判断肾脏损伤的部位。 国内部分实验室采用 SDS-PAGE 盘状电泳进行尿蛋白分离,该法具有局限性,耗时,操作繁琐,标本要求高, 尿液需预浓缩,不适于临床实验室广泛开展。SDS-AGE 电泳不需预浓缩,尿 蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区,带主要反应肾小球病变;呈现出低 分子量蛋白区带,可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿;混合性蛋白尿则可见 到大、中、小各种分子量区带,示肾小球及肾小管均受累及。扫描仪可对电 泳后尿液中蛋白质剖象进行扫描,求出百分比,以显示肾小球或肾小管损伤 程度,其电泳图谱及扫描图形可作为资料永载,利于分析比较。该技术的最 大进步是尿液不需预浓缩,操作简便,结果清晰,仅需三小时即可完成试验, 还备有完整的定性标准,易于量化,便于分析,对肾脏疾的诊断,鉴别诊断, 指导治疗和判断愈合颇有价值。 四、电泳技术的展望 中国在电泳技术临床应用上与国外相比,存在一定的差距。若按照国外 实验室标准,国内三级甲等、三级乙等医院均需配备自动电泳仪,但目前国 内不少三级甲等医院仍没有使用这类设备。电泳项目国内一般也只以血清蛋 白为主,而国外所做项目包括血清蛋白、尿蛋白、CK、LD、ALP、GGT 同 功酶、各种脂蛋白的胆固醇/甘油三酯等。对于分析用的电泳试剂,欧美这几

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年均以琼脂糖凝胶电泳片占 95%以上,国内仍有 40%市场采用醋酸纤维素薄 膜电泳片,这也是与国外差距较大的地方。但是,近年来一些在大专院校、 科研院所使用的科研类电泳技术,如高效毛细管电泳、毛细管电泳芯片、电 泳-色谱-质谱联用等,已开始在临床实验室使用。如果能有公司厂家开发像生 化分析仪上的试剂一样,生产出质量稳定、相关参数明确的专门配套试剂, 将加快其推广应用的进程。 从目前临床实验室的要求来看电泳仪必须具有下列功能: (1)全自动化:必须达到人员离机作业,由点样到出报告机器全能完成。 (2)速度快:所有项目应在 60min 内完成同时具备急诊项目如 CK、LD 等 同工酶及亚型项目。为临床提供及时、准确的诊断信息。 (3)项目齐全:除了血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、CK、LD 同工酶等传 统项目外必须还能完成尿蛋白、脑脊液蛋白、免疫固定(单克隆抗体)、碱性磷 酸酶(ALP)和(?-谷氨酰转肽酶(GGT)同工酶、胆固醇(高密度/极低密度/低密度 脂蛋白)、脂蛋白(a)等最新检验项目。 (4)敏感度高:必须采用敏感度高的电泳片。如琼脂糖凝胶系统,才能得 到准确度高,分辨率高的电泳结果。 现已有较新研究报道蛋白电泳用于泪液、唾液和头发蛋白质分析。而且 电泳技术方面的临床进展也日新月异,上个世纪 90 年代中期,测序仪重大改 进,集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳。2001 年完成人类基因组框架图提前 完成得益于多通道、集束化的毛细管凝胶电泳技术的出现。近期发展起来的 毛细管电泳是一种新型的区带电泳,又称毛细管带电泳,它能检测尿样、血 浆、血清、脑脊液、红细胞、其他体液或组织,以及实验动物活体等样品。 能对蛋白质、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活 性分子、离子、药物及其代谢产物等物质分离。广泛用于临床疾病诊断、临 床蛋白质分析、临床药物分析、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR 产 物分析、DNA 片段及序列分析等。由于它具有高效、快速、灵敏、应用范围 广、所需样品少和可自动化等特点,正逐渐被广大临床实验室所接受。随着 国际、国内科技发展的日新月异和检验医学发展的突飞猛进,电泳技术也在 不断发展和更新,相信随着电泳技术的不断发展,其在临床医学和分子生物 学领域将有广阔应用前景。

作业布置:

名词解释:
1.电泳 2.毛细管电泳的电场强度 3.蛋白质的等电点 4.电泳速度 5.迁移率

湘 潭 职 业 技 术 学 院 6.毛细管电泳技术 7.电泳淌度 8.迁移时间 9.毛细管电泳电渗流 10.焦耳热 11.电渗 12. 吸附作用

课后小结: (授课后总结,可手写)


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