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微生物菌种保藏方法


微生物菌种保藏方法
1、传代保存法:有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时,会很快死亡,因此在这种情况下, 只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存,它是最 基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时,培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓 度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种, 则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地,大多数菌种的保藏温度以 5℃为好,像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微 生物菌种则可以使用 37℃进行保存,而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便,但其缺点也很明显,如:①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌 株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时,菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及 形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种,工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法:该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母 菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥,并通过限制氧的供给而达到削弱微生物 代谢作用的目的。其具有方法简便的优点,同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能 力低的丝状菌)的保存,而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及 沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法:即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包 括以下几种,如 ①土壤保存法: 主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。 方法是在灭菌的土壤 中加入菌液, 立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥, 然后冷藏或在室温下密封保存。 保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜,土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。 使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是: 取适量土壤(5 克)置于塞有棉塞的试 管中,加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的 60%为宜),然后高 压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种,培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止,移入干 燥器中经短时间干燥或风干后密封,冷藏或室温保存。

②砂土保存法: 取清洁的砂, 60 目筛去掉大砂粒, 过 并用磁铁吸去砂中铁屑, 再用 NaOH 溶液、10%HCl 溶液和水交替清洗数次,干燥后,置于试管或安瓶管中保持 2~3cm 深,再经 干热灭菌后,加入 1ml 菌种培养液,经充分混匀后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保 存。也可用二份洗净的砂(经 HCl 预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌,再进行菌种 保藏。 ③硅胶保存法:以 6~16 目的无色硅胶代替砂子,干热灭菌后,加入菌液。加菌液时, 由于硅胶的吸附热常使温度升高,因而需设法加以冷却。 ④磁珠保存法: 将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。 在 螺旋口试管中装入 1/2 管高的硅胶(或无水 CaSO4),上铺玻璃棉,再放上 10~20 粒磁珠, 经干热灭菌后,接入菌悬液,最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很 有效,特别适用于根瘤菌,可保存长达两年半时间。 ⑤麸皮保存法:在麸皮内加入 60%的水,经灭菌后接种培养,最后干燥保藏。 ⑥纸片(滤纸)保存法:将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中,常压或减压干燥后,置于装 有干燥剂的容器内进行保存。 4、悬液保存法:即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有, ①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即 可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。 ②糖液保存法:适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于 10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保 存,可长达 10 年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。 5、寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。 6、冷冻保存法:适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的 情况下而不受损伤,而对其它大多数微生物而言,无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结,都 会对菌体造成损伤,因此当采用这种保藏方法时,应注意以下几点, ①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞;

②要选择适宜的培养基, 因为某些微生物对冷冻的抵抗力, 常随培养基成分的变化而显 示出巨大差异; ③要选择合适的菌液浓度,通常菌液浓度越高,生存率越高,保存期也越长; ④最好在菌液内不添加电解质(如食盐等); ⑤可在菌液内添加甘油等保护剂, 以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。 同样, 也可添加各种糖类、 去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂, 但对有些微生物而 言,不加保护剂时更有效。 ⑥原则上应尽快进行冷冻处理,但当加入保护剂时,可静置一段时间后再进行处理。 ⑦就动物细胞而言, 应在-20℃范围内以 1℃/min 左右的速度缓慢降温, 此后必须尽快 降到贮藏温度; 而对绝大多数微生物而言, 则不必如此, 如结构较为复杂的原虫则可在-35℃ 范围内进行缓慢降温,而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻; ⑧若进行长期保存,则贮藏温度越低越好; ⑨取用冷冻保存的菌种时,应采取速融措施,即在 35~40℃温水中轻轻振荡使之迅速 融解。 而就厌氧菌来说, 则应选择静置融化的措施。 当冷冻菌融化后, 应尽量避免再次冷冻, 否则菌体的存活率将显著下降。 常用的冷冻保存法包括: ①低温冰箱保存法(-20℃、 -50℃或-85℃): 低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方 便, 也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。 保存时菌液加量不宜过多, 有些可添加保护剂。 此外, 也可用 φ 5mm 的玻璃珠来吸附菌液, 然后把玻璃珠置于塑料容器内, 再放入低温冰箱内进行 保存的。 ②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。 ③液氮保存法(-196℃):是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下, a、装安瓶管:使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭 菌溶液中,将 0.2~1ml 的这种溶液分装于安瓶中,或在装有分散剂的安瓶中直接接种,或 将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。

b、熔封安瓶管:若直接贮存于气相液氮中(-150℃~-170℃)时,则不需熔封。 c、检查安瓶管是否熔封良好:即在 4℃下,将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡 2~ 30 分钟后,观察有无色素进入安瓶。 d、缓慢冷却:将熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮气以约 1℃/min 的速度冷却至- 25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱内缓慢冷却 30~60min。 e、速冷:最后浸入液氮中快速冷却至-196℃。 7、冷冻干燥保存法:其原理是首先将微生物冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水 分。事实上,从菌体中除去大部分水分后,细胞的生理活动就会停止,因此可以达到长期维 持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保 存。 在进行冷冻干燥时,需注意以下几个问题: a、冷冻干燥前的培养条件:首先检验菌种纯度。一般地说,将待保存的微生物在营养 丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜; 菌龄以达到对数生长期为好; 若为有芽孢或孢子 的微生物, 则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好; 菌液浓度以高为好, 如细菌应达到 109~ 1010/ml。 b、菌株号码等的标记:可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。 c、安瓶的准备:将安瓶在 2%HCl 中浸泡过夜,自来水冲洗 3 次后,蒸馏水刷净,干燥, 塞棉塞,贴标签,干热灭菌或温热灭菌后,60℃恒温干燥。 d、添加保护剂:常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加 7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加 7.5%葡萄糖的血清等等。 8、Bordelli 氏法:取干净的小试管(8×60mm)塞上棉塞,灭菌。用灭菌的脱脂牛乳洗 脱试管斜面上的菌苔,制成浓厚菌悬液。然后用无菌吸管将菌悬液滴入小试管底部。每管一 滴,然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记菌名。将小试管装在 15×150mm 的试管中, 在大试管底部事先装上 1.5cm 高的(P2O5 或 KOH), 管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧, 蜡封。将大试管与真空泵连通,抽真空至 0.1~0.2mm 汞柱时,将玻璃管熔封,置室温暗处 或冰箱保存。

仪器与材料 1、斜面菌种:丝状真菌、酵母菌、芽孢杆菌和无芽孢杆菌各一支。 2、接种用具一套。 3、灭菌物品:1ml、5ml 吸管,长滴管,安瓶管,9ml 无菌水试管,砂土管,液体石蜡, 脱脂牛乳。其中,液体石蜡的处理为 1.5kg/cm2 压力灭菌 1 小时或 1kg/cm2 压力灭菌 3 次, 每次 30 分钟。 接着检查是否彻底无菌, 即接入肉汤中检查有无杂菌生长。 最后放在 60~80℃ 轰烤以去除水分。脱脂牛乳的处理为 2000rpm 离心 10 分钟脱脂,然后 0.5kg/cm2 压力灭菌 20 分钟,或间歇灭菌 3 次,经检查无菌后备用。 4、P2O5,无水 CaCl2 各一瓶。 5、真空干燥器,真空泵。 方法 1、液体石蜡覆盖法:取待保存的菌种斜面,用 5ml 无菌吸管向内加入灭菌石蜡,要求 液体石蜡高出菌斜面 1cm 左右,若不够此高度,则常会引起斜面抽干现象。 2、砂土管法:用 1ml 无菌吸管吸取 0.2~0.5ml 菌悬液,滴入砂土管中,充分混匀后, 将砂土管放入真空干燥器内,抽干,真空干燥器内需放置无水 CaCl2。最后,将干燥好的砂 土管取出,迅速于火焰上蜡封管口,并在室温下或冰箱中进行保存。 3、冷冻干燥保藏法: ①用灭菌长滴管取出 2 滴(约 0.1ml)无菌脱脂牛乳,置于无菌安瓶管中,然后用另一支 无菌滴管取出等体积的浓菌液,同样置于此安瓶管中,充分混匀。 ②集中安瓶管,置于 100ml 烧杯中,将烧杯装进真空冷冻干燥器的钟罩内,开机并开冷 却水后,使菌液在-20℃温度下迅速冻结成固体,然后抽真空使水分升华,2 小时后,可以 停止冷冻并在稍高的温度下进行干燥,直至全干为止。 ③最后取出安瓶管,并将其与真空泵连接,再抽真空后,迅速将安瓶管熔封,最后冰箱 保存。

4、甘油管保藏法:在 5ml 菌种保藏管中,将等体积的菌悬液和 40%的甘油充分混匀后, 于-20℃冰箱中保存。


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