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组培重点问答题


四问答题(30) 1 植物组织培养的应用现状 植物组织培养研究和应用范围十分广泛 基础理论研究:采用组织和细胞培养法可以进行植物细胞发育生理学、生物化学、细 胞遗传学及分子生物学等方面的研究。 应用研究: (1)无性系快速繁殖 (2)植物脱病毒 (3)种质保存 (4)植物育种 (5)有用次生代谢物质生产 (1) 无性系快速繁殖 目前国内外都认为无性系快繁是组培应用的主流之一,用组

培的 方法进行无性繁殖,具有用材料少、速度快,并不受自然环境条件的影响 等特点。 彩色马蹄莲的组培苗的规模化生产技术 大蒜根尖诱导成芽 美国红栌 榉树的愈伤组织的诱导和植株再生

(2) 植物脱病毒 原理:病毒在植物体内的不均匀分布 在感染的植株体内,顶端分生组织一般无病毒或病毒数量极少, White1943 年就发现生长点附近的病毒浓度很低,甚至无病毒。因此,可 以用组织培养的方法,切取一定大小的茎尖(分生组织)进行培养,可从 已感染病毒的植株上获得无病毒植株(准确地说是除去有危害的病毒) 。 (3)种质保存 he 目前世界上许多国家对种质资源的保 存十分重视(基因成为战略资源) ,不少国都建立了“种质库”。 保存植物种质资源的传统方法是贮存种子、块茎、根、鳞茎、球茎、根 茎、芽和插条等。除贮存室外,温室和田间也是保存种质资源的场所。然而,以这些方式 保存种质资源时的确面临许多困难。因此,植物组织培养技术日渐发展成为种质资源保存 的有效手段,可以代替田间资源圃、苗圃或温室来保存植物。 (4)植物育种 在当代的作物育种上,国内外已普遍地采用植物组织 培养方法,大体上有以下几个方面:胚培养、花粉培养、原生质体培养与细胞杂交(细胞融 合) 、突变体筛选、遗传转化(转基因)等。 1、胚培养: ,而采用胚的早期离体培养可以使胚正常发育并成功地培养出杂交 后代。若在杂交中受精有困难,也可以把未受精的胚珠分离出来,在试管内用花粉受精, 此 法 称 “ 试 管 受 精 ”, 发 育 成 的 植 株 被 称 为 “ 试 管 植 物 ”。 2、单倍体育种(花粉培养) :利用花粉培养进行单倍体育种, 单倍体育种具 有高速、高效、基因型一次纯合等优点。 3 原生质体培养和细胞杂交:

到目前为止已有数十种属间体细胞杂种和几例科间体细胞杂交成功的报道。 4 突变体筛选与育种:把植物细胞培养在附加一定化学物质的培养基上,用生物化学 的方法,大量筛选高品质、高抗性等拟定目标的突变体。 5 遗传转化:通过化学、物理以及生物途径有目的地将外源基因导入受体植物基因 组中,以期改良植物的遗传性状。被导入的外源基因称为转基因,所得到的植株称为转基 因植物。 (5)有用次生代谢物质生产 质 天然色素:食品添加剂、化妆品 类葫萝卜素----从葫萝卜、单冠毛菊、薄荷、蔷薇、万寿菊等植物的愈伤组 织中提 取。 叶黄素-----从葫萝卜、薄荷、蔷薇、万寿菊中提取。 药物、保健品:人参皂甙、人参二醇、人参三醇(均从人参根愈伤组织中提取) 。 因此,利用单细胞培养方法,将植物体内合成某种特殊物质能力强的细胞筛 选出来,使之投入工业化生产,用以提取对人类有用的酶制品、医药制品和食品添加剂。 这也是组织培养广泛应用的一个方面。 利用植物组织培养技术生产有用物

2 组织培养室设计及基本设备\ 建筑设施:资料室、培养基配制室(准备室) 、接种室、培养室、驯化室 (一)培养基配制室(准备室、前处理室) 主要用于器具的洗涤、干燥、培养基的制作、植物材料的粗调整等。 准备室应配置实验台、试剂柜、仪器柜等。在该室要配制培养基和使用高压灭菌器,要求 有良好的水电供应。同时,准备室的环境需要相对整洁,以减少菌群的污染。因此,准备 室要求干燥洁净、光线充足、墙壁要使用耐水、耐腐蚀的材料装修,并安装换气扇。 主要仪器设备: 1、药品柜: 。2、试验台: 3、天平:1)药物天平(2)托盘式扭力天平(2)托盘式扭力 天平 4、冰箱:普通冰箱(2)低温冰箱:5、烘箱: 6、电热蒸馏水器 7、磁力搅拌器: 8、pH 计: 9、高压消毒锅: 10、电炉(电磁炉) 11、锅(或其它容器) : (二)接种室(无菌室) 主要设备 1.超净工作台 2、解剖镜 3、显微镜 4、器械类:镊子、弯头镊子、钝头镊子: 尖头镊子。 解剖刀、解剖针: 打孔器 5、紫外灯: 6、低速离心机:用于沉淀细胞 或制备原生质体 7、抽气泵: 8、细菌过滤器 9、磨砂口玻璃瓶:用来对植物材料进行表 面灭菌。10、酒精灯:用来进行接种器材的表面灭菌 (三)培养室 植物组织培养室与动物组织、微生物培养室略有不同,其特殊之 处是需要有一定的照明设备。培养室的大小可根据生产规模和现有条件来设计,为了保证 培养材料的正常生长,必需要满足一定的温度、湿度、光照及空气的无菌程度等条件。 3 培养基中的各种组分在培养中的作用 培养基中的各种组分在培养中的作用

(一)水 配制培养基时,使用的水原则上以重蒸馏水或蒸馏水为好,可减少水 中杂质对植物材料分化生长的影响。 (二)无机营养元素(inorganic nutrition) 无机营养成分是指植物在生长发育时所需要的各种化学元素。根据植物对无 机营养的吸收量,可将它们分为大量元素和微量元素,前者是植物的生长发育的基本营养 物质,所需的量较大,后者虽然需要量较少,但却具有重要的生理作用。 1.大量元素 :培养基中含量超过 100mg/L 的无机元素,包括 N、P、K、Ca、 Mg、S 等。 2.微量元素 :培养基中含量低于 100mg/L 的元素,主要有铁、硼、锰、锌、 铜、钼、钴、氯。 不同的基本培养基(MS,White、N6、B5 等)中无机营养元素种类和添加量不 同。就各种无机营养元素在培养基中的浓度组成来讲,到目前为止,研究也比较深入,也 就是我们前面讲的一些基本培养基中已有各种浓度,按照其浓度配制就可。但需要说明的 是,这些基本培养基中的成分与浓度,并非不可改变, (三)有机营养元素(organic compound) 植物组织培养中,分化后的植物体处于异养或半异养状态。因此,在基本培 养基中必须加入植物生长发育所需的各种有机物质,如碳水化合物(糖类) 、维生素类、氨 基酸类等。 1.碳水化合物(carbohydrate) :又称碳源,是重要的能源物质。可为外植体 生长发育提供所需的碳骨架,并具有维持培养基渗透压的作用。最常见的碳源有蔗糖、麦芽 糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、葡萄糖和果糖等。不同糖类对不同植物外植体生长的影响不 同。以洋兰类为例,大花蕙兰在以蔗糖作碳源时其生长发育较用麦芽糖、葡萄糖或果糖好; 而果糖对石斛 2、维生素(vitamin) :维生素类在组培所起的作用是很重要的,它能直接参与 生物催化剂—---酶的形成,以及蛋白质和脂肪代谢等。在组织培养中,很多组织虽然也能 合成一些维生素,但实验证明,在培养基中外加维生素,组织会生长的更好。 3、氨基酸(amino acid) :培养基中还需要某些氨基酸,如甘氨酸、精氨酸、谷氨 酰胺等。氨基酸是蛋白质的组成成分,对培养物的生长有促进作用。 (四)植物生长调节物质 植物组织培养中常用的是生长素类、细胞分裂素类和赤霉素 1、生长素类:主要作用是促进被培养物的生长,诱导愈伤组织的形成,促进 生根。 3、赤霉素类 与生长素和细胞分裂素相比,在组织培养中,赤霉素(gibberellins,GA)的使用 较少。 4、脱落酸 脱落酸主要生理作用有:①抑制蛋白质的合成、细胞分裂和伸长,抵消和抑制生长 素、细胞分裂素和赤霉素发挥作用。②诱导休眠,促进衰老和脱落,提高抗逆性。通常情 况下植物组织培养中不使用脱落酸。但 ABA 对体细胞胚的发生和发育有重要作用,适量添 加外源 ABA 可明显提高体细胞胚的发生频率和发育质量,抑制异常体细胞胚的发生。ABA 具 有促进休眠、抑制生长的作用,可以用于培养物及种质资源的超低温保存。 5、多胺 多胺(polyamines,PA) ,是生物代谢过程中形成的具有重要生理活性的小分子脂 肪族含氮碱,对植物的生长发育、形态建成和抗逆性等具有重要调节作用。多胺在组织培

养中的应用最近几年才逐渐增多,可用于调控部分培养物不定根、不定芽、花芽、体细胞 胚的发生和发育。另外,多胺在延缓原生质体衰老、促进原生质体分裂及细胞形成等方面 具有积极作用。 6、多效唑 又名氯丁唑或 PP333,是一种生长延缓剂。它具有如下生理作用:控制生长,促进矮 化,促进分枝、分蘖,促进生根,促进成花和坐果;延缓衰老;提高叶绿素含量,增强植 物抗逆性。在组织培养中,多效唑主要用于试管苗的壮苗、生根,增强抗逆性及提高移栽 成活率等方面。 (五)活性炭类 活性炭具有较强的吸附功能,可吸收培养物分泌的抑制物质和琼脂中含有的杂质。 从而抑制褐变、促进生根(相对黑暗的条件) 、减轻玻璃化。但活性炭的吸附没有选择性, 培养基中的一些植物必需的某些化合物也同样被吸收,大量活性炭的加入会消弱琼脂的凝 固能力。 (六)培养基支持体 在培养基的组成中,除上述各种试剂外,还需要支持体来保证培养材料在培养 基上固定和生长。琼脂是目前最为常用的培养基支持体,它是从海藻中提取的一种高分子 碳水化合物,本身不提供任何营养。能溶于温度 95℃左右的热水中,成为溶胶;当温度降 至 40℃以下时开始凝固。琼脂在培养基中的使用浓度为 6~10g/L。用量过高,配制的培养 基过硬,导致培养物吸收营养困难,致使材料分化发育迟缓;用量太少,配制的培养基过 软,培养物在培养基中不能稳定地支撑,甚至下沉,较易发生玻璃化现象。培养基 pH 值过 低,或者高压灭菌时间过长,都可能导致培养基发软。 4 快速繁殖的特点 (二)特点 (1)繁殖系数高、繁殖速度快 利用植物的繁殖器官在人工培养基上反复继 代增殖,1 年内 1 个繁殖体可以繁殖出数以万计的、整齐一致的种苗。繁殖系数可以达到几 万倍甚至几百万倍。 (2)用材少:繁殖中使用的植物材料极少,往往只要少量的外植体即可在培 养容器中建立反复增殖的系统。对于珍贵稀有的植物还能做到不毁坏原有植物。同时,可 以节省常规营养繁殖时所需要的大量母本植物和因栽培和保持这些母株所需的土地和人 力。 (3)占用空间小 离体繁殖是在玻璃或塑料容器中进行,占用的空间极小, 在实际应用中,每 m2 培养面积一年约可生产一万到几万株苗,一个熟练工人一年约可生产 数万株试管苗。 (4)周年生产 离体繁殖过程是在人为提供的条件下进行的 ,可以不受地 区、气候、季节和病虫等影响,可以在任何地方、任何时间进行 (5)便于种质保存和交换 田间种植保存是植物种质资源保存中最常采用的方法之一。利 用离体繁殖的方法,可以将种质资源保存在试管中,取代大田种植保存方式。既节约了大 量人力、物力和土地,还避免了病虫的危害,尤其是经鉴定和脱毒的种质资源,在繁殖、 转运和交换过程中能完全避免病虫害为害和再感染病毒,有利于种质资源的安全传递和交 换。 (6)有利于无病毒苗的培育 部分作物由于病毒病的蔓延而造成产量下降和 品质变劣的现象已成为生产中的一个主要问题之一,而病毒病又极难防治。利用离体培养 技术是获得无病毒苗木的有效途径之一。 (7)有利于其他的相关科学研究 离体繁殖的试管苗,可随时提供正在生长的

小植株,又可在人工完全控制的条件下进行研究和试验,排除了其它干扰,提高实验的准 确性和缩短试验周期。 、 5 离体繁殖再生植株途径 离体繁殖再生植株途径 植物种类、外植体类型及培养基组成等都会影响离体培养材料的生长、分化 和再生,使外植体的器官形成方式表现出一定的差异。根据器官形成方式不同,植物离体 培养再生植株的途径主要包括腋芽萌发(Formation of axillary buds) 、体细胞胚胎发生 (Somatic embryogenesis) 、不定器官发生(Organogenesis)和原球茎形成(Formation of PLB) 。 1、腋芽(顶芽)萌发 腋芽萌发又称器官型再生,是指由培养的顶芽或腋 芽直接萌发形成小茎后,再诱导小茎生根而形成完整植株的过程。众所周知,芽是缩短的 茎,而芽的顶端(Shoot tips or meristems)包含着许多芽及其原基。在离体条件下茎尖 及其所包含的腋芽萌发,并进一步发育成小茎。 2、胚状体发生型 胚状体发生型是指外植体在适宜的培养环境中,形成类似于合子胚结构的胚 状体(Embryoids)或体细胞胚(Somatic embryos) 。体细胞胚与合子胚一样具有胚根和胚 芽两极性。成熟的胚状体可以像合子胚一样长出根、芽,萌发再生植株。 3、不定器官发生型 离体培养条件下不定器官的发生可以通过直接或间接途径由外植体表 面分化出不定芽或不定根等器官,并进一步发育成完整植株。直接器官发生是由外植体表 面直接形成不定芽,如在适当条件下叶片外植体的边缘可以诱导形成不定芽;而间接器官 发生途径是指外植体首先脱分化形成愈伤组织,然后由愈伤组织上重新分化出不定芽等器 官。间接器官发生是不定器官发生的主要方式,大多数植株再生是通过间接器官发生途径 实现。器官发生包括不定芽(Formation of adventitious buds)和不定根(Formation of adventitious roots ) 以 及 不 定 芽 和 不 定 根 在 愈 伤 组 织 的 不 同 部 位 ( Formation of adventitious buds and roots)分别形成 3 种途径。 4、原球茎形成型 原球茎形成型是兰属植物特有的再生植株途径。兰属植物外植体接种于 培养基上,经过一段时间的培养便能形成原球茎,然后每一个原球茎可以进一步发育成完 整植株,且原球茎可以进一步增殖。 茎尖培养→原球茎 (基部带有原根的小球体,多时可形成 10 多个)→切割原 球茎(3~4 片)→培养基上培养→每片又形成数个原球茎(3~5 个)→反复进行。一个茎尖一 年内可增殖上百万株,若停止分切,由每个原球茎可发育成一个完整的小植株。 6 组培苗移栽后的管理 7 写出某种植物的组织培养程序(月季或大叶黄杨)
外植体的消毒、接种 一、目的要求 掌握外植体消毒与接种的无菌操作技术。 二、原理 组织培养中要求无菌室、超净工作台内达到无菌状态,植物材料也要经过消毒灭菌。 三、用品用具 材料:植物茎段 试剂:75%酒精、0.1%升汞、无菌水 器具:超净工作台、培养皿、刀、镊子、酒精灯 四、方法和步骤

1、接种前的准备工作 灭菌:超净工作台(紫外灯照射 30min,通风 20min),接种器械(刀、镊子、培养皿、培养基高 压灭菌) 双手:肥皂洗手,酒精灭菌。 2、外植体的消毒 剪取植物幼嫩茎段 3—5cm,去掉叶片,洗洁精清洗 10min,再用流水冲洗 30min,在超净工作台 上用 75%酒精浸泡 30s,再用 0.1%升汞浸泡 8min 左右,用无菌水清洗 3—5 次。 3、接种

① 将工具喷过酒精后置于工作台上; ② 把解剖刀、镊子等浸泡在 75%酒精中,在火焰上灭菌后,放在架子上; ③ 将材料置于无菌培养皿内,切取 1—2cm 带腋芽茎段,打开封口膜,用火焰烧瓶口,然 后将材料接种到培养基中,封口; 注意: 应使茎段形态学上端向上,接种时瓶口要倾斜,材料要悬空; 手、工具要经常消毒。 4、结束后标记,清理关闭超净工作台。 五、实验结果 计算发芽率和污染率 (总芽数 162 个,发芽数 59 个,污染数 6 个)


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