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转基因动物技术 课件


Transgenic Technology

Definition
Transgenic technology refers to the genetic engineering of an organism so that its genomic DNA is altered to over- or underexpress certain genes.

? ? ? ? ?

Transgenic technique Gene Knock Out Gene Knock In Gene Knock Down Gene Trapping

? mouse, rabbit, rat, sheep, pig, caw etc.

? The 2007 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells.

Oliver Smithies

Martin J. Evans

Mario R. Capecchi

Evans’s work: The ES cells
embryonic stem cell,ES somatic stem cell ? Stem cell

? Martin talks about his work

Mario Capecchi and Oliver Smithies, independently of each other, discovered how homologous recombination between segments of DNA molecules can be used to target genes in the mammalian genome and developed methods to generate genetically modified mice.

转基因小鼠构建过程
? ? ? ? 构建打靶载体 ES细胞打靶和筛选 囊胚注射 动物杂交筛选

北京诺兰信科技 北京高校生物技术转化平台

25 Health Sciences Drive Stony Brook, NY 11790-3350,USA

http://www.genetargeting.com/

一、打靶载体

定点突变技术

STRATAGENE, Agilent Technologies Inc

分子开关--Cre/Loxp 系统
Cre:由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶,不仅具 有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的 DNA 序列。 可以特异性的识别并催化34个碱基重复序列的loxP 之间的DNA同源重组。

Loxp位点:[ locus of crossing-over (x) in P1 ] site:

Cre-LoxP系统的特性
? Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、 可逆的过程,可以分成三种情况: ? 1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上,且方 向相同,Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序 列; ? 2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上,但方 向相反,Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒 位; ? 3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA 链或染色体上,Cre酶能介导两条DNA链的交换或染 色体易位。

两个loxp位点的方向相反
promoter

loxp

Gene Cre

loxp

promoter

loxp

Gene

loxp

? Knock-out gene ? Knock-out stop cassette

? Knock-out label

FLP/frt重组系统
? 来自啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ? 其中重组酶FLP可催化位于同一分子上 两个同向frt位点间DNA片段的同源重 组,实现基因切除的效果。 ? 作为“第二分子开关” FLP/frt系统与 Cre/loxP系统一起,更精密的调控基因 表达

时间控制和组织特异性表达
? Cre的表达还可以通过在启动子上引入相 应某种配体的元件(比如某种药物)而达 到时间控制和组织特异性表达。 ? 四环素、1型干扰素、三苯氧胺 (Tamoxifen,可以与一种与雌激素受体 相互作用的蛋白相结合)都被用于获得药 物诱导型的启动子。

Si-Bmi-1

LSL-Cre : loxp-stop-loxp, Cre FSF-Flpo: FRT-stop-FRT, Flpo Established Lung Tumors

二、ES细胞打靶和筛选

? HSV-tk:单纯疱疹病毒胸苷激酶,自杀基因 ? HSV-tk基因的产物使细胞能利用培养基中的 GANC (Gancyclovir,丙氧鸟苷)而死亡 ? 例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区 与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶(VZVTK)基因进行重组,构建逆转录病毒载体导 入体内,TK基因只在肝癌细胞中表达,产生 的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产 生araAMP,进一步磷酸化形成细胞毒物质 araATP,杀死肝癌细胞。

? Neo基因 卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷 酸转移酶II,基因记做neo,能通过降解 G418、新霉素和卡那霉素来实现真核和原 核细胞的相应抗性。 一般应用于原核生物就是卡那霉素抗 性基因,应用于真核生物就是G418抗性。

外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法

三、囊胚注射和杂交筛选

小鼠基因型的鉴定?

? 标准品系: ES细胞品系:E14Tg2a (129背景);
Agouti毛色)

JM8(C57BL/6N品系); JM8A3(C57BL/6N 品系,

注射用囊胚品系:C57BL/6×C57BL/6

? 129和C57BL/6纯系小鼠 近交系Inbred Mice

C57BL/6

129

? C57BL/6品系较纯,回交较少代数后性 状就能稳定。 ? 129品系ES细胞的优点是它们比较皮实, 容易操作。 C57BL/6 ES cell比较娇嫩。

表1.用基因打靶法制备的一系列重要的基因敲除小鼠及表型: 敲除基因
RAG-1和/或RAG-2 TcRβ TcRα P56lck CD3-ζ CD45 MHC-Ⅱ,不变链 CD4 MHC-Ⅰ,β-2微球蛋白 TAP1/TAP2 TcR-δ P59fyn IgM穿膜区 Λ5 IL-2 CD40L CD28

表现型
因无TcR基因重排而无T细胞 双阴性胸腺细胞聚集,双阳性胸腺细胞很少,TcRα正常重排 有双阴和双阳T细胞而无单阳性T细胞 T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻,无?δT细胞 T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻 T细胞发育在双阳性成熟期受阻 无CD4+T细胞,CD4+CD8-/+很少,正常NK,1.1+CD4+,CD8+正常 CD8 +数量和功能正常 无CD8+ T细胞,CD4+T细胞正常 无?δT细胞,对结核杆菌易感性增加 T细胞发育正常,T细胞应答缺损 晚期CD43+B聚集,无等位基因排斥 CD43 +细胞聚集,部分成熟B细胞出现延迟 IgG1, IgG2a,IgG2b自身抗体增加 高IgM,无生发中心,低IL-12和IFNγ,巨噬细胞活化受阻 IgG1,IgG2b减少

转基因动物的维持

Duke University Laboratory Animal Resources Center

胚胎的冷冻保存

国家遗传工程小鼠资源库
联系人:郭仕英 联系电话:025-58641520 Email: guosy@nicemice.cn 网址:www.nicemice.cn 地址:南京市浦口区学府路12号

美国实验动物公司
The Jackson Laboratory
Telephone+1.207.288.5845 Fax+1.207.288.6150 Mail: The Jackson Laboratory Customer Service 610 Main Street Bar Harbor, Maine 04609-1500 U.S.A. Online:JAX? Mice Online Order Request Form (secure interactive PDF) Email: orderquest@jax.org

美国实验动物公司
Charles River Laboratories, Inc. 251 Ballardvale Street Wilmington, MA 01887-1000 For General Inquiries Phone: 978-658-6000 Fax: 978-658-7132 Email: comments@crl.com

The end


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