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谷氨酸发酵工艺


第二章

谷氨酸发酵机制

第一节 谷氨酸发酵机制
1.谷氨酸的作用:谷氨酸(g1utamate,Glu, C5H9O4N)是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神 经递质,主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状 体,在学习、记忆、神经元可塑性及大脑发育等方 面均起重要作用。此外,谷氨酸对心肌能量代谢和 心肌保护起着重要作用。

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一、谷氨酸生物合成途径
生物体内合成谷氨酸的前体物质是a-酮戊二酸, 是三羧酸循环(TCA循环)的中间产物,由糖质原料 生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径(EMP途径)、 三羧酸循环、乙醛酸循环、CO2的固定反应(伍德一 沃克曼反应)等。

(一)、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环 和乙醛酸循环 葡萄糖
1.糖酵解途径(EMP途径) 将一分子葡萄糖分解成 两分子丙酮酸,并且发生 氧化(脱氢)和生成少量 ATP。
6-磷酸葡萄糖 6-磷酸葡萄糖酸
EMP途径 HMP途径

3-磷酸甘油醛

5-磷酸核酮糖

丙酮酸

2.戊糖磷酸途径(HMP途径) 可以生成酵解途径的中间产物6-磷酸果糖和 3-磷酸甘油醛。

肌肉中的葡萄糖代谢情况

3.三羧酸循环(TCA循环)
丙酮酸
+CO2

乙酰CoA

草酰乙酸 柠檬酸 苹果酸 顺乌头酸 延胡索酸 乙醛酸 异柠檬酸 琥珀酸 α -酮戊二酸
α -酮戊二酸脱氢酶 NH4 异柠檬酸脱氢酶 乙醛酸循环中的两个关键 酶——异柠檬酸裂解酶和 苹果酸合成酶。

谷氨酸 (胞内)

转移到胞外

(二)谷氨酸合成的理想途径
生物素充足菌EMP所占比例约为62%; 在发酵产酸期,EMP所占比例更大,约为74%。

(三)由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
1.谷氨酸生产菌株为缺陷型,生产过程分为菌体生 长期和谷氨酸积累期。 2.此代谢途径至少有16步酶促反应。 3.在谷氨酸发酵的菌体生长期,由于三羧酸循环中 的缺陷(丧失a-酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力 微弱),谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环途径进行代谢, 提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。

4. 在菌体生长期之后,进入谷氨酸生成期,封闭 乙醛酸循环,积累α -酮戊二酸,就能够大量生 成、积累谷氨酸。 因此在谷氨酸发酵中,菌体生长期的最适条 件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。

5. 由葡萄糖生 物合成谷氨酸的 代谢途径

6.葡萄糖对谷氨酸的转化率
(1)在谷氨酸生成期,假如四碳二羧酸是100 %通过C02固定反应供给,在生长期之后,理 想的发酵按如下反应进行:

1mol葡萄糖可以生成1mol的谷氨酸,谷氨酸对葡萄 糖的质量理论转化率为:

(2)在谷氨酸生成期,若 CO2固定反应完全不起作用, 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催 化作用下,脱氢脱羧全部氧 化成乙酰CoA,通过乙醛酸 循环供给四碳二羧酸。反应 如下: 3C6H12O6 乙醛酸循环: 4乙酰CoA +4H2O 2琥珀酸+4CoASH 6丙酮酸 6乙酰CoA

6乙酰CoA +2NH3+3O2 2谷氨酸+2CO2+6H2O

3mol葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸,谷氨 酸对葡萄糖的质量理论转化率为:

(3)实际转化率:处于二者之间,即54.4%~ 81.7%。 CO2固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影 响较大。 乙醛酸循环活性越高,谷氨酸越不易生成与积累。

7.醋酸或正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径 在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时,却只能 经乙醛酸循环供给四碳二羧酸,四碳二羧酸经草酰 乙酸又转化为柠檬酸。

二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制
分解代谢: 从环境中摄取营养物质,把它们转 微生物 的代谢
化为自身物质,以此来提供能源和 小分子中间体;

合成代谢:合成代谢将分解代谢产生的能量和
中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质 等物质。

在工业上,通过对微生物代谢途径的控制来满足 生产的需要,提高生产效益。 所以,研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。

1.糖代谢(EMP途径和HMP途径)的调节
糖代谢可分为分解与合成两方面。 糖分解代谢包括酵解与三羧酸循环;(提供能量) 合成代谢包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成 等,中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。 (消耗能量)

(1)能荷的调节 腺嘌呤核苷三磷酸,又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸), 简称为ATP。 其结构简式是:A—P~ P~P,其相邻的两个磷 酸基之间的化学键非常活 跃,水解时可释放约 30.54kJ/mol的能量, 因此称为高能磷酸键。

Atkinson提出了能荷的概念。 认为能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量, 能荷大小可以说明生物体中ATP—ADP—AMP系统的 能量状态。能荷的大小决定于ATP和ADP的多少。 能荷调节是通过ATP、ADP和AMP分子对某些酶 分子进行变构调节来实现的。

能荷逐渐升高时,即细胞内的能量水平逐渐升高, 这一过程中AMP、ADP转变成ATP。 ATP的增加会抑制糖分解代谢,抑制如柠檬酸合 成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性,并激活糖类合 成的酶,加速糖原的合成。
糖酵解主要受三个酶调节:磷酸果糖激酶、己糖激酶、 丙酮酸激酶,其中磷酸果糖激酶是限速酶,己糖激酶控制 酵解的入口,丙酮酸激酶控制出口;三羧酸循环的调控由 三个酶调控,即柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和ā-酮戊 二酸脱氢酶。两者都与能荷的控制调节相关。

当生物体内生物合成或其它需能反应加强时,细 胞内ATP分解生成ADP或AMP,ATP减少,能荷降低, 就会激活某些催化糖类分解的酶(糖原磷酸化酶、磷酸 果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)或解除 ATP对这些酶的抑制,并抑制合成糖原的酶(NN合成 酶、果糖-1,6~二磷酸酯酶等),从而加速酵解、 TCA循环产生能量,通过氧化磷酸化作用生成ATP。

(2)生物素对糖代谢速率的调节
生物素对糖代谢的调 节与能荷的调节是不同的, 能荷是对糖代谢流的调节, 而生物素能够促进糖的 EMP、HMP途径、TCA 循环。

谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型。许多研究表 明,生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的 比例并没有显著的影响,主要作用是对糖降解速率的 调节。
原因:碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的许多反应都需要生 物素。 生物素的主要功能是在脱羧-羧化反应和脱氨反应中起辅酶 作用,并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白 质向脂肪的转化有关。 在碳水化合物代谢中,生物素酶能催化脱羧和羧化反应。 碳水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有:丙酮酸转化生成 草酰乙酸;苹果酸转化为丙酮酸;琥珀酸与丙酮酸的互变;草 酰琥珀酸转化为α-酮戊二酸。

2.三羧酸循环(TCA循环)的调节
谷氨酸产生菌在代谢途径中,三羧酸循环的调节主要 是通过5种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢 酶和α-酮戊二酸脱氢酶。
草酰乙酸+谷氨酸
谷氨酸转氨酶

天冬氨酸+α -酮戊二酸

谷氨酸比天冬氨酸优先合成,谷氨酸合成过量后, 谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶 的合成,使代谢转向天冬氨酸的合成。

①磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑 制,受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。 ②柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶,除受能 荷调节外,还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反 馈抑制。
反馈抑制:是指最终产物抑制作用,即在合成过程中有生物合成途径的终点 产物对该途径的酶的活性调节,所引起的抑制作用。
反馈抑制与反馈阻遏的区别在于:反馈阻遏是转录水平的调节,产生效应慢, 反馈抑制是酶活性水平调节,产生效应快。此外,前者的作用往往会影响催 化一系反应的多个酶,而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。

③异柠檬酸脱氢酶活力强,而异柠檬酸裂解酶活力不 能太强,这就有利于谷氨酸前体物α-酮戊二酸的生成, 满足合成谷氨酸的需要。 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成α– 酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸还 原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应, 细胞内α–酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡, 当α–酮戊二酸过量时,对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制 作用,停止合成α–酮戊二酸。

④沿着由柠檬酸至α–酮戊二酸的氧化途径,谷氨酸产 生菌有两种NADP专性脱氢酶,即异柠檬酸脱氢酶和L谷氨酸脱氢酶。 在谷氨酸的生物合成中,谷氨酸脱氢酶和异柠檬 酸脱氢酶在铵离子存在下,两者非常密切地偶联起 来,形成强固的氧化还原共轭体系,不与NADPH2 的末端氧化系相连接,使α–酮戊二酸还原氨基化生 成谷氨酸。

由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微生 物强大得多,所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧 化中间物就不再往下氧化,而以谷氨酸的形式积累 起来。 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈 阻遏。若铵离子进一步过剩供给时,发酵液偏酸性, pH在5.5~6.5,谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺。

⑤在谷氨酸产生菌中,α–酮戊二酸脱氢酶先天 性缺失或微弱,对导向谷氨酸形成具有重要意 义,这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征。

谷氨酸产生菌的α–酮戊二酸氧化力微弱,尤其 在生物素缺乏的条件下,三羧酸循环到达α–酮 戊二酸时即受到阻挡,这有利于α–酮戊二酸的 积累,然后生成谷氨酸。

3.乙醛酸循环(DCA循环)的调节
乙醛酸循环中的关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸 酶。通过乙醛酸循环异柠檬酸裂解酶的催化作用使 琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足,其反应 如下:

葡萄糖和琥珀酸等对异柠檬酸裂解酶起着阻遏作用。

(1)以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对 DCA循环的影响

在生物素亚适量条件下,琥珀酸氧化力降低, 积累的琥珀酸会反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性,并 阻遏该酶的生成,DCA循环基本处于封闭状态, 异柠檬酸高效率地转化为α–酮戊二酸,再生成谷 氨酸。 在生物素充足的条件下,异柠檬酸裂解酶活性 增大,通过DCA循环提供能量,进行蛋白质的合 成,不仅异柠檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得 谷氨酸减少,而且生成的谷氨酸在转氨酶的催化作 用下又转成其它氨基酸,也不利于谷氨酸积累。

(2)以醋酸为原料的谷氨酸发酵对DCA循环的影响

以醋酸为原料发酵谷氨酸时,醋酸浓度要低,高浓度 的醋酸易被完全氧化。 当菌体内的有机酸浓度低到一定程度,DCA循环启 动,此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内 的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶,TCA循环转为 DCA循环,不利于谷氨酸生成与积累; 当DCA循环运转使得TCA循环包含的某些有机酸过剩 时,异柠檬酸裂解酶被抑制,乙醛酸浓度下降,解除 对异柠檬酸脱氢酶的抑制,TCA循环运转。

4.CO2固定反应的调节
CO2固定反应主要通过以下途径完成:

C02的固定反应的作用:补充草酰乙酸; 在谷氨酸合成过程中,糖的分解代谢途径与C02固定 的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。

5.NH4+的调节

谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化脱氨反应,脱 氨过程以NAD+作为辅酶,该酶催化的反应虽然偏向 氨合成谷氨酸一边,但是脱氢过程产生的NADH被氧 化成NAD+,同时产生的NH3很容易被除去。 脱氨反应被NH4+和α–酮戊二酸所抑制,这对于谷 氨酸的积累也起到了很好的作用。

在谷氨酸发酵生产中,生物素缺陷型菌在 NH4+存在时,葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率 高; NH4+不存在时,葡萄糖消耗速率很慢,生 成物是α–酮戊二酸、丙酮酸等物质,不产生谷氨 酸。

四、细胞膜通透性的调节
对谷氨酸发酵的重要性: 当细胞膜转变为有利于谷 氨酸向膜外渗透的方式, 谷氨酸才能不断地排出细 胞外,这样既有利于细胞 内谷氨酸合成反应的优先 性、连续性,也有利于谷 氨酸在胞外的积累。

细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有 弹性的半渗透性膜,磷脂双分子层为其基本结构, 在双分子层中镶嵌蛋白质。

根据细胞膜的结构特性,控制细胞膜 通透性的方法主要有两种: 一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成,实现对磷脂 合成的控制,使得细胞不能形成完整的细胞膜; 一种是通过干扰细菌细胞壁的形成,使得细胞不能 形成完整的细胞壁,丧失了对细胞膜的保护作用。 在膜内外渗透压差等因素影响下,细胞膜物理性损 伤,增大膜的通透性。

1.控制细胞膜的形成
①利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时,限制 发酵培养基中生物素的浓度。 生物素参与了脂肪酸的生物合成,进而影响了 磷脂的合成和细胞膜的形成。 生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰 CoA羧化酶的辅酶,对脂肪酸的形成起促进作用。 选育生物素缺陷型菌株,阻断生物素合成,亚适量 控制生物素添加,抑制不饱和脂肪酸的合成,使得 细胞膜不完整,提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。

②利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时,添 加表面活性剂或饱和脂肪酸。 在生物素过量的条件下,添加表面活性剂或饱和 脂肪酸仍能进行谷氨酸发酵,其原因在于这些物质对 生物素起拮抗作用,抑制不饱和脂肪酸的合成,导致 油酸合成量减少,磷脂合成不足,使得细胞膜不完整, 提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。常用的表面活性剂 有吐温-60、吐温-40等。常用的饱和脂肪酸有十七烷 酸、硬脂酸等。

③利用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵,限制发酵培养基 油酸的浓度。 油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力,直接影 响磷脂的合成,不能形成完整细胞膜,必须添加油酸才能 生长,所以通过控制油酸的添加量,实现细胞膜对谷氨酸 的通透性。 当油酸过量时,该菌株只长菌或产酸少;当油酸亚适 量时,随着油酸的耗尽,细胞膜结构与功能发生变化,使 得谷氨酸的通透性提高。
一种脂肪酸。 分子式C18H34O2

④利用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵, 限制发酵培养基甘油的浓度。
甘油缺陷型菌株不能自身合成α– 磷酸甘油和磷脂,外界供给甘油 才能使其生长,因此可以通过控 制甘油添加量来控制细胞膜对谷 氨酸的通透性。 当甘油添加量过多时,磷脂正 常合成,菌体正常生长,不产酸 或产酸低; 当甘油添加量过少时,菌体生 长不好,产酸低,所以控制甘油 亚适量是控制的关键。

2.控制细胞壁的形成

细胞壁的骨架结构 是肽聚糖。 对细胞壁形成的控 制方法:添加青霉 素、头孢霉素C等 β-内酰胺类抗生素。

双糖单位:N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙 酰葡萄糖胺(NAG)

青霉素控制细胞壁形成的原因: 青霉素是糖肽末端结构(D—Ala—D—Ala)的类似物, 与转肽酶的活性中心结合,使转肽酶受到了不可逆的 抑制,糖肽合成不能完成,结果形成不完整的细胞壁, 使细胞膜处于无保护状态,易于破损,增大谷氨酸的 通透性。

转肽酶功能:在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。转 肽酶识别特异多肽,催化不同的转肽反应。

第二节

谷氨酸产生菌的选育

主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属 中的细菌。 目前,我国企业使用的谷氨酸产生菌主要有: 北京棒杆菌AS 1.299; 钝齿棒杆菌AS 1.542; 天津短杆菌T6-13; 它们的各种突变株。

黄色短杆菌

北京棒杆菌

杆状细菌

谷氨酸菌体的选育方法主要有五种,自然选育、 诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选 育。

一、自然选育
也称自然分离,是指对微生物细胞群体不经过人工 处理而直接进行筛选的育种方法。
以基因自发突变为基础。 有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种,使谷氨酸生产 具有相对稳定性,提高发酵水平。 缺点:菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作 用,使得自发突变率极低,导致选育耗时长、工作 量大、效率低。

二、诱变选育
物理因素:紫外线、60Co、X射线、γ-射线、快中 子、α-射线、β-射线、超声波、He-Ne激光辐照、 离子束等。 化学因素:氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺 酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、5-氟尿嘧啶、5溴尿嘧啶等。 其它因素:生物诱导因子,如噬菌体诱发抗性突变 等。

例: 王岁楼;张一震;李志。谷氨酸高产菌TZ-310的诱变 选育及其发酵的研究 。中国调味品,1997年 09 期 。 摘要:以天津短杆菌T6-13为出发菌株,经60C o—γ 射线、紫外线和硫酸二乙酯复合诱变并经高温 驯化,获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。 该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸(GA)、不分解利 用GA及耐高温(38℃~45℃)的优点。

三、杂交育种
常规杂交 杂交育种 原生质体融合 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解 作用加以剥除,制得原生质体或原生质球,在高渗条 件下混合,由聚乙二醇(PEG)助融,促使原生质体凝 集、融合,两个基因组之间接触、交换、遗传重组, 在再生细胞中获得重组体。

谷氨酸产生菌的前处理 因为其有着特殊的细胞壁结构,对溶菌酶一般不 敏感。 方法:加入EDTA(乙二胺四乙酸 )、甘氨酸、青霉 素和D-环丝氨酸等,这些物质可以使细胞壁变得 疏松,便于溶菌酶处理。
如,李蒲兴等将6株谷氨酸产生菌以 甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同组合 处理,对其原生质体形成进行比较, 在最佳条件下,原生质体形成率可达 95%~100%。

张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌 T6-13为出发菌株,获得了具有目的 遗传标记寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗 性(FEAr)的突变株TN63和TN115。 然后,分别以TN63和TN115为亲株, 通过原生质体融合,获得了具有Orm +FEAr标记的融合子FTN9108,其原 生质体融合频率为2.6×10-3。

Orm

+

FEAr

Orm

FEAr

Orm FEAr

四、代谢控制选育
Glu产生菌

以诱变育种为基础,获得 各种解除或绕过微生物正 常代谢途径的突变株,从 而人为地使有用产物选择 性地大量生成积累。

诱变育种 突变株 代谢控制发酵 大量积累Glu

1.选育耐高糖、高谷氨酸的菌株 如选育在含20%~30%葡萄糖的平板上生长良好的 耐高糖突变株; 在含15 %~20%味精的平板上生长良好的耐高谷 氨酸突变株; 在20%的葡萄糖加15%味精的平板上生长良好的耐 高糖、耐高谷氨酸的菌株。

2.选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断 支路代谢的菌株 (1)选育不分解利 用谷氨酸的突变株
谷氨酸
瓜氨酸 鸟氨酸 精氨酸 谷氨酰胺

选育在以谷氨酸为 唯一碳源培养基上 不长或生长微弱的 突变株 。

(2)选育强化CO2固定反应的突变株
a.选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源,生长良好的 菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧 反应,该反应与C02固定反应是相同酶所催化, C02固定反应相应地加强。

b.选育氟丙酮酸敏感突变株。 因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂,即抑制 丙酮酸向乙酰CoA转化,相应地CO2固定反应加强。 突变株对氟丙酮酸越敏感,效果越理想。 c.选育减弱乙醛酸循环的突变株。 乙醛酸循环减弱不仅能使C02固定反应比例增大, 而且异柠檬酸也能高效率地转化为α-酮戊二酸, 再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型 突变株和不分解利用乙酸的突变株。

(3)选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的 突变株

α -酮戊二酸 NH3

谷氨酸脱氢酶

谷氨酸

谷氨酸转氨酶

天冬氨酸+α -酮戊二酸

草酰乙酸

有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性 突变株和谷氨酰胺抗性突变株。

(4)选育强化能量代谢的突变株 原因:使TCA循环前一段代谢加强,谷氨酸合成速 率加快。
a.选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二 酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来 实现。 b.选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育 2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实 现。 c.选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如 可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。

(5)其它遗传标记

选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸 类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸 缺陷、AEC抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨酸等突 变株,都可以不同程度地提高谷氨酸产量。

3.选育能提高谷氨酸通透性的菌株
(1)选育生物素缺陷型菌株。 (2)选育油酸缺陷型菌株。 (3)选育甘油缺陷型菌株。 (4)选育温度敏感型突变株
突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜 结构的基因上,发生碱基的转换或颠换,一个碱基为另一 个碱基所置换,这样为基因所控制的酶在高温下失活,导 致细胞膜某些结构的改变。 另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨 酸。

(5)其它突变型菌株 抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙 酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等,都能增 强谷氨酸的通透性。

五、基因工程选育
基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进 行改造而获得高产工程菌,或者是通过微生物间的 转基因而获得新菌种的育种方法。
载体系统 :一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体,尤以质粒 为多。 受体系统 :受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。 供体菌株:供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异 株。 工具酶:切割供体DNA和载体DNA的工具酶——限制性内切 核酸酶有许多种,HindⅢ、Bcl I、Xba I和Xam I效果最好。

载体系统 受体系统

供体菌株 工具酶

谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因已被克隆,Ozaki等克 隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因, 通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌,产量提高了50%。

周盛等从大肠杆菌E.coli k-12中通过PCR克隆出磷酸果糖 激酶编码基因(pfkA),将其连到表达载体,连接构建成重 组质粒pKu-1,转化谷氨酸棒杆菌B4,并得到表达;酶活 性测定表明pf-kA基因表达活力为128.6±o.86u/g的蛋 白。同时,转化子菌株对糖转化率比B4高10.64%,产酸 率比B4高17.1%。


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