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2.1《微生物的实验室培养》课件(新人教版选修1)


专题2 :微生物的培养与应用

病毒
微生物基础知识

病毒界

细菌
真菌 原生动物

微生物包括哪五类: 放线菌

原核生物界 真菌界
原生生物界

特点:结构都相当简单,个体多数十分微小.通 常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到,有 的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿 素.不能进行光合作用.

细菌的外形与大小
细菌:单细胞不分枝的原核微生物。 细菌细胞微小而透明,通常用适当染料染 色后显微镜观察

细菌的构造

细菌细胞由外向里 依次有鞭毛、菌 (纤)毛、荚膜、 细胞壁、细胞膜、 细胞质,细胞质 中又有液泡、储 存性颗粒、核质 等。

图1-3

细菌的结构

*细胞壁
结构特点:坚韧且有弹性 ? 细胞壁有哪些功能? ? ①固定细胞外形;
?
? ?

②保护细胞免受外力的损伤; ③阻拦大分子物质进人细胞; ④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。

伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素

有些细菌在一定的条件下,细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体,叫做芽孢。芽孢的壁很厚,对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如,有的细菌的芽孢,煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻,可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水 分适宜)的时候,芽孢又可以萌发,形成一个细菌.

菌落:
? 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时,

就会形成一个肉眼可见的,具有一定形态结 构的子细胞群体,叫做菌落。 ? 菌落是鉴定菌种的重要依据。

菌落
细菌的菌落特征 因种而异

放线菌
1、结构: ?单细胞原核 ?分支状的菌丝(基内菌丝、气生菌丝)

应用:
链霉素、土霉素、四环素、 氯霉素、红霉素、庆大霉素

微生物中发现了几千种抗生素,其中2/3是 由放线菌产生的

病毒的结构

病毒

SARS病毒、

禽流感病毒

朊病毒(蛋白质病毒)

2、病毒的增殖:

真菌

酵母菌和霉菌

青霉 如图是酵母菌电子显微 镜下的形态结构

生殖

孢子生殖

直立菌丝

营养菌丝

腐生生活

细菌的营养类型
? 根据细菌所利用的能源和碳源的不同,

将细菌分为两大营养类型。 ? 自养菌(autotroph) ? 异养菌(heterotroph) ? 腐生菌 ? 寄生菌 大部分病原菌

一、课题目标: 了解有关培养基的基础知识,进行无 菌技术的操作,进行微生物的培养。 二、课题重点和难点: 无菌技术的操作。 三、技能目标: 掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和 平板划线法等基本操作技术,熟练、规范 地进行无菌操作,成功地培养微生物。

一、基础知识:
(一)培养基 培养基(培养液)是由人工方法配制而成 的,专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。 1.培养基的类型和用途 (1)按物理状态来分:培养基可分为固体培 养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌 种分离、鉴定菌落等。 (2)按功能来分,可分为选择培养基和鉴别 培养基。 (3)按成分来分,可分为天然培养基和合成 培养基。

2.不同的微生物往往需要采用不同 的培养基配方 (参考教材附录内容)
3.不管哪种培养基,一般都含有水、 碳源、和氮源、 无机盐、等营养物质, 另外还需要满足微生物生长对pH、特殊 营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必 需,而自身不能合成的化合物,如维生素、 某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二 氧化碳、渗透压等的要求。

选择培养基
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基: 分离杂交瘤细胞

合成培养基:
根据细胞生存所需物质的种类和 数量,用人工方法模拟合成的。 合成培养基主要成分是氨基酸、 维生素、碳水化合物、无机盐和其它 一些辅助物质。 优点:标准化生产,组分和含量相 对固定;成本低 缺点: 缺少某些成分,不能完全满 足体外细胞生长需要。

天然培养基:
天然培养基有血清、血浆、和组 织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 优点:营养成分丰富,培养效果好 缺点:来源受限;成分复杂,影响对某 些实验产物的提取和实验结果的分析; 易发生支原体污染;

人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细 胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如 血清)。

血清中含有: ①多种蛋白质(白蛋白、球蛋 白、铁蛋白等) ②多种金属离子; ③激素; ④促贴附物质,如纤粘蛋白、 冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分

液体培养基:

表面生长

均匀混浊生长

沉淀生长

固体培养基:菌落,菌苔

半固体培养基:

无动力

有动力(弥散)

(是否运动)

4.培养基的用途 液体培养基:增菌 固体培养基:纯化,增菌 半固体培养基:动力检测,保种

(二)无菌技术
1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中, 所有防止杂菌污染的方法。无论是随后 将要学到的倒平板、平板划线操作,还 是平板稀释涂布法,其操作中的每一步 都需要做到“无菌”,即防止杂菌污染。 只有熟练、规范地进行无菌操作,才可 能成功地培养微生物。

2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

(1)消毒定义: 利用化学或物理方法,杀死大部份 致病微生物的过程。区分为高程度消毒 (High-level Disinfection)、中程度 消毒(Intermediate-level Disinfection)、低程度消毒(Lowlevel Disinfection)三种方式。

(2)灭菌的定义:

以化学剂或物理方法消灭所有微 生物,包括所有细菌的繁殖体、芽孢、 霉菌及病毒,而达到完全无菌之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工 作中最普通也是最重要的技术。

3.常用的消毒与灭菌的方法 (1)消毒的方法:
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法:70-75 ℃下煮30min 或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁 尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ……

(2)灭菌的方法:
1、灼烧灭菌 2、干热灭菌: 160-170 ℃下加 热1-2h。 3、高压蒸气灭菌: 100kPa、121 ℃ 下维持15-30min.

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌,它可以 杀灭所有的生物,包括最耐热的某些微生物的休 眠体,同时可以基本保持培养基的营养成分不被 破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了 防止杂菌,特别是空气中的杂菌污染,试管及玻 璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口,通常采用棉花 塞,也可采用各种金属、塑料及硅胶帽,它们只 可让空气通过,而空气中的其他微生物不能通过 。 而平皿是由正反两平面板互扣而成,这种器 具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

无菌技术
分类 灭菌法 高效消 毒法 中效消 毒法 低效消 毒法 定义 方法 物理法:热力、辐射、微 杀灭一切微生物 波、等离子体 化学法:醛类、烷化剂 杀灭一切致病微 紫外线、含氯剂、臭氧、 生物 复配剂等 杀灭除芽孢外的 超声波、碘类、醇类、酚 致病微生物 类 杀灭细菌繁殖体、 单链季胺盐、双胍类、中 亲脂病毒 草药、金属离子

3.微生物实验室培养的基本操作程序 1、器具的灭菌 2、培养基的配制 3、培养基的灭菌 4、倒平板 5、微生物接种 6、恒温箱中培养 7、菌种的保存

1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外,还有什么目的? 答:无菌技术还能有效避免操作者自 身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭 菌。如果需要,请选择合适的方法。 (1) 培养细菌用的培养基与培养皿 (2) 玻棒、试管、烧瓶和吸管 (3) 实验操作者的双手 答:(1)、(2)需要灭菌;(3)需要消毒。

三、实验操作 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌)

操作步骤 1.计算、称量 2.溶化 3.调pH: pH7.6 4.过滤:这一步可以省去。 5.分装:分装过程中注意不要使培养 基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而 引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过 三角烧瓶容积的一半为宜。 6.加塞 7.包扎

8.灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中, 塞上棉花塞,包上牛皮纸,再放入高压蒸气灭菌 锅,在压力为100kPa、温度为121℃,灭菌 15~30min。将培养皿用旧报纸包裹,放入干 热灭菌箱内,在160~170 ℃下灭菌2h。 9.倒平板: 待培养基冷却到50 ℃左右时,在酒精灯附 近倒平板。(倒平板操作见课本)2d后观察平 板,无杂菌污染才可用来接种.

10.无菌检查: 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培 养24—48小时,以检查灭菌是否彻底。

倒平板技术

1.培养基灭菌后,需要冷却到50 ℃左右时, 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度?

答:可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时,就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?

答:通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生 物污染培养基。

3.平板冷凝后,为什么要将平板倒臵?
答:平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固 后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒臵, 既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
4.在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位,这个平板还能用来 培养微生物吗?为什么? 答:空气中的微生物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板 培养微生物。

2、纯化大肠杆菌 微生物的接种技术 接种方法有: 平板划线法和稀释涂布平板法

平板划线法:通过接种环在琼脂固体 培养基表面连续画线的操作,将聚集的 菌钟逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细 胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体, 这就是菌落.

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环?在划线操作结束时,仍然需 要灼烧接种环吗?为什么? 答:操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线 前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种 环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的 菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线 次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少, 以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时 杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和 感染操作者。

2.在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却 后再进行划线? 答:以免接种环温度太高,杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时,为什 么总是从上一次划线的末端开始划线?
答:划线后,线条末端细菌的数目比线条起 始处要少,每次从上一次划线的末端开始, 能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步 减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌 落。

涂布平板的所有操作都应在火焰附近 进行。结合平板划线与系列稀释的无菌 操作要求,想一想,第2步应如何进行无 菌操作?
应从操作的各个细节保证“无菌”。 例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、吸管要 在酒精灯火焰周围等等。

微生物的恒温培养

微生物的恒温培养

微生物的恒温培养

菌种的保存

1、临时保藏: 接种到固体斜面培 养基,菌落长成后 臵于4℃冰箱保存。 2、长期保存: 甘油冷冻管藏法

四、课题成果评价
(一)培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2 d后无菌 落生长,说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制 备。 (二)接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本 一致,并符合大肠杆菌菌落的特点,则说明接种操作是 符合要求的;如果培养基上出现了其他菌落,则说明接 种过程中,无菌操作还未达到要求,需要分析原因,再 次练习。 (三)是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显 不同,及时观察记录的同学会发现这一点,并能观察到 其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良 好的科学态度与习惯。

本课题知识小结:

【典例解析】
例1.关微生物营养物质的叙述中,正确的是 答案:D A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量 解析:不同的微生物,所需营养物质有较大差别,要 针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项,它的表达是 不完整的。有的碳源只能是碳源,如二氧化碳;有的碳源可 同时是氮源,如NH4HCO3;有的碳源同时是能源,如葡 萄糖;有的碳源同时是氮源,也是能源,如蛋白胨。对于C 选项,除水以外的无机物种类繁多,功能也多样。如二氧化 碳,可作为自养型微生物的碳源;NaHCO3,可作为自养 型微生物的碳源和无机盐;而NaCl则只能提供无机盐。对 于D选项,无机氮源提供能量的情况还是存在的,如NH3可 为硝化细菌提供能量和氮源。

例2.下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 B A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
解析:灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的 是灭菌的目的,因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种, 整个发酵过程不能混入其他微生物(杂菌),所以是正确 的;B是错误的,因为灭菌的目的是防止杂菌污染,但实 际操作中不可能只消灭杂菌,而是消灭全部微生物。C是 正确的,因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌;发 酵所用的微生物是灭菌后专门接种的,灭菌必须在接种前, 如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。

例3.右表是某微生物 编号 培养基成分,请据此回答: ① (1)右表培养基可培 ② 养的微生物类型 是 。 ③ 自养型微生物 (2)若不慎将过量 ④ NaCl加入培养基中。 ⑤ 如不想浪费此培养基, ⑥ 可再加入 含碳有机物 . ⑦

成分 粉状硫

含量 10g

(NH4)2SO4
K2HPO4 MgSO4

0.4g
4.0g 9.25g

FeSO4 CaCl2 H 2O

0.5g 0.5g 100ml

(3)若除去成分②,加入(CH2O),该培养基可 用于培养 固氮微生物 。 (4)表中营养成分共有 类。 3 (5)不论何种培养基,在各种成分都溶化后分装 前,要进行的是 调整pH 。 (6)右表中各成分重量确定的原则 依微生物的生长需要确定 是 。 (7)若右表培养基用于菌种鉴定,应该增加的成 分是 琼脂(或凝固剂) 。


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