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2-1植物组织与细胞培养技术


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第二章 植物组织与细胞培养

一、 植物组织培养定义
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是指在无菌的条件下,将离体的植物器官、组织、 细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配制的培养

基上,给予适当的培养条件,诱发产生愈伤,长
成新的完整植株的一种实验术。

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二 、发展历史
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1、探索阶段(20世纪初至20世纪30年代)
1902年,德国植物学家哈伯兰德(Haberlanclt)就预言,植物细胞具有 全能性,即高等植物的器官和组织可以不断分割,直至分到单个细胞的 观点,并设想离体植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。

而且进行了相关实验:培养植物叶片细胞。
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因此,被称为—— 植物组织培养的father

?2、奠基阶段(20世纪30年代中至50年代未)
两个重要发现:1、认识了B族维生素对植物生长的重要意义; 2、发现了生长素是一种天然的生长调节物质。 1933年我国的李继侗和沈同研究银杏的胚培养,将银杏胚乳提取物加入培养基, 获得成功。

1934年Went 发现了生长素。随后相继发现了吲哚丁酸、萘乙酸和2,4-D等。 B簇维生素。
1934年,美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系,使根的培养首 次获得了真正的成功。(培养基:无机盐、酵母提取物和蔗糖,后来用3种B族 维生素:吡哆醇、硫胺素和烟酸取代酵母浸提物获得成功) 1934年Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现培养基中加了B族 维生素和IAA后,形成层的生长明显增加,揭示了B族维生素和IAA在植物组织 培养中的作用,直接导致了1939连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。 1939年Nobecourt的胡萝卜也建立了连续生长的培养物。 故三人被誉为植物组 织培养的奠基人。

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1943年,white 正式提出了植物细胞具有全能性的学说.
1948年,Skoog和催澄在烟草茎段和髓培养以及器官形成 的研究中发现,腺嘌呤或腺苷可以解除生长素(IAA)对芽 形成的抑制作用,而诱导形成芽,从而确定了腺嘌呤/生长 素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。

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1956年,Miller发现了激动素后,用它代腺嘌呤的效果更好。 1958年,在美国工作的英国人Stewward,从胡萝卜愈伤组 织和细胞培养中,诱导分化产生了个体植株,给“全能性”

理论以科学论证。

3、迅速发展阶段(20世纪60年代至现在)
1960年,Cocking用真菌纤维素酶在番茄幼根分离得到大量活性原生质体,开创了植 物原生质体和体细胞杂交研究工作。Kanta在植物试管受精研究中首次获得成功。 1960年,Morel用兰花茎尖培养实现了脱去病毒和快速繁殖方面已获成功,导致欧洲、 美洲和东南亚等许多国家兰花工业的兴起。(茎尖-原球茎-小植株) 1962年Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成,这就是目前我 们常用的MS培养基。 1964--1966年,印度的Guha和Maheshwari成功地在毛叶曼佗罗花药培养中由花粉诱

导得到了单倍体植株。
1970年Power首次成功实现原生质体融合。1971年Takebe等首次由烟草原生质体获得 再生植株,这一成功促进了体细胞杂交技术发展,同时也为外源基因导入提供了理想 的受体材料。1972年,Carlson等通过原生质体事例首次获得了两个烟草物种的体细胞 杂交种。 1978年Murashige提出了人工种子的概念。 20世纪80年代初,随着土壤农杆菌成功的用于植物遗传转化,植物基因工程开始成为

研究的热点。1983年Zambryski首次用农杆菌转化烟草,获得首例转基因植物。

三、特点
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1.培养条件可人为控制

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2.生长周期短繁殖率高
3.管理方便,利于自动化

4.遗传品质一致
5.培养材料经济 6.误差小、重复性强

四、意义和应用
(1)能够有效保持优良品种特性
(2)获得无病毒植株

(3)快速繁殖新品种,加速优良品种推广
(4)节约耕地,提高农民产品产出率 (5)在遗传、生理生化和病理等研究上的应用 (6)便于运输与种质资源保存

五 、 实验室、设备要求和实验室设计

植物组织培养是在无菌的条件下进行离体植物材料 培养的技术。要达到无菌操作和无菌培养,

首先 是要有一定的无菌环境,使用无菌的容器和用
具(经过灭菌处理的)进行无菌操作,将无菌的植

物材料接种在无菌的培养基上,

然后 把要培养的植物材料放在一定的温度、湿度、
光照、营养条件下,使其生长、发育和繁殖,这就 必须要有一定的设备和条件。

5.1

植物组织培养室的基本结构
选址: 在建造植物组织培养室时,应选择采

光好、通风好、环境干净的地点,以利于组织培养的 顺利进行和降低培养过程的污染率。 实验室:植物组织培养工作的开展除需要培养 室外,还应该有与之配套的洗涤室、药品室、称量室、 培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、细胞学实 验室、暗室和物品存放室等。

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(1)洗涤室
洗涤培养容器、小用具等,要求有工作台面、 上水和下水,水池、培养容器摆放支架、电源、 电热干燥箱等。洗涤室墙壁要有耐湿、防潮功 能。 新购进的玻璃器皿首先要用1%左右浓度的稀盐 酸将可溶性无机物除去,再用中性洗涤剂洗涤, 一般器皿的洗涤可用洗衣粉洗涤,或用洗衣粉 加热洗涤,用自来水冲洗干净。

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?对较难洗涤的培养容器,如吸管

等可在重铬酸钾洗液中浸泡后再洗,

洗到玻璃表面上不沾水滴才算合乎
要求。

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(2)药品贮藏室
要求干燥、通风,避免光照,有存放各种药品试剂
的药品柜、冰箱等设备,化学试剂、玻璃器皿等物 品分类存放于柜中,有毒物品(HgCl2)需要专人密

封保存,需低温保存的药品和药液放臵于冰箱中贮
藏,药品贮藏室紧邻化学称量室较好,便于工作。

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(3)称量室(天平室)
要求干燥、密闭,无直射光照,避免腐蚀性药品 和水气直接接触。有固定的水磨石平台,安放普通 天平和万分之一分析天平(电子天平),要有电源 插座,最好设计在阴面的房间,这样对怕光药品的 保存和称量有利,称量室紧邻培养基配制室较好, 以方便配制母液和培养基。如房间较少时,可以与 药品储藏室合二为一。

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(4)培养基配制室
主要进行培养基的配制、分装和灭菌前的暂时存放。配 制的培养基需要实验台,上下水,电源,加热设备等。 配制培养基室要求备有各种试管、三角瓶、烧杯、量筒、 吸管等玻璃器皿,有安放药品和器皿的各种橱架、水浴 锅、过滤灭菌装臵和酸度计等。 规模较小时, 可与洗涤室合并在一起。

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(5)培养基灭菌室
器皿和培养基的消毒灭菌,最好在一个专用的灭菌室内进
行。由于采用高温高压蒸汽灭菌方法,灭菌室最好有排除 蒸汽的排风扇等。建筑上要求其墙壁耐湿、耐高温。 有用于干热灭菌的烘箱、湿热灭菌的高压蒸汽灭菌锅、蒸 馏水器、水源、水池,供、排水设施。

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有用于灭菌的两相和三相电源或煤气加热装臵,摆放和存
放器皿和培养基的架子和橱柜。 规模小时,可与洗涤室和配培养基室合并。

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(6)培养基存放室
灭菌的培养基最好存放一段时间后进行接种工作,
以防污染和损失苗木。 规模小时,可与洗涤室、配培养基室和灭菌室合 并。

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(7)过度室(缓冲室)
为避免进出时带进杂菌,无菌室外应该设臵预备室,
作为缓冲间。预备室和无菌室之间最好用玻璃墙隔离, 便于观察和参观。

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在预备室中可放臵工作服、鞋、帽等,也需要安装自
来水、水池和紫外灯,用于接种前的洗手和紫外灭菌, 电源开关最好安装在预备室外边,以免在开关灯时紫 外线对眼睛和皮肤造成伤害。

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(8)接种室
无菌室的好坏对组织培养成功与否起重要作用。无菌
操作室主要进行繁殖材料的表面灭菌和试管苗的继代 培养和材料转接,要求室内干净、密闭,光线好。

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一般安装滑动门,以免造成空气流动,引起污染。
室内墙壁光滑平整,地面平坦无缝,便于清洁工作。 应该安装紫外灯,以便照射 灭菌,还要有照明装臵及插 座,以备临时增加设备之用。

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室内有超净工作台、接种用的小推车以及试管、三角瓶、 塘瓷盘、酒精灯、接种工具等。 平房易吸潮,容易引起污染,因此有条件的设计应选择 楼房,最好在二层或二层以上,与其他区域隔离。

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为保证无菌室的良好条件,可预先用福尔马林熏蒸,工 作台用70%酒精药棉擦拭,在 开紫外灯灭菌前应 该把所有需要的物 品放入。不要造成 死角,以免紫外灯 无法照射到。此外 还应该设有消防设施。

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(9)培养室
培养室是培养材料进行培养和生长的场所,培养室的大 小应根据培养架的数量和生产规模而定。 植物组织培养需要较长的培养时间,同时还须考虑温度 和光照的影响。通常培养室的温度保持在适宜一般植物 生长的范围内,多为20~27 ℃,光照强度在1000 lx以 上。 一般光照强度1000-5000 Lx,

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每天光照时间8~16 h。

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培养室应设计成多个小培养间比一个大房间效果好,因

为小的培养间容易控制温度、光照等环境指标,特别是 培养材料较少时节能效果更为明显。
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培养多种植物时的优点更为突出,如不同植物所需的培

养温度、光周期不同,所设定的培养温度和光周期不可 能适合培养的每一种植物。小培养间也可以减少污染, 培养室容易消毒和保持清洁。
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至少设计成一大一小两间培养室,这样可以防止万一环 境污染,不至于全军覆没;也可以用大的培养间大量繁 殖苗木,小的用来科研及少量珍稀品种试验;当不同培 养材料需要不同的培养条件时,便于分别处理。

(10)细胞学实验室
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为观察、记录培养材料的生长情况及实验结果,需
要有细胞学实验室。细胞学实验室应有固定的水磨石台 面,放臵显微镜、解剖镜等仪器。室内应安静、干净、

清洁、明亮,保证光学仪器不振动、不受潮、不污染。
室内还应该有一套染色设备,因为有时为了观察清楚需 要染色或进行制片观察。

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(11)暗室
试验材料的摄影记录,一般可以用装有照相装臵的显微 镜、解剖镜进行,有时需要用照相机直接拍摄完整材料。
进行拍摄后需要冲卷和洗相,这就必须有配套的暗室,

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以便及时看到结果。
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在暗室应有冲洗、印相、放大、上光等设备。 有固定的水泥工作台面,还要有电源和自来水装臵。

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(12)物品存放室
暂时不用的器皿、用具等贮存在物品存放室内。物品存 放室应当设计在背阳、通风的房间,室温较低,一般用 楼房的低层的阴面房间较好,便于搬运。

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(13)温室(大棚)
试管苗移栽必须在温室或塑料大棚内进行。 试管苗移栽时一般要求温室最低温度在15 ℃

以上,相对空气湿度在70%以上。

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5.2组织培养常用仪器设备及要求

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(1)玻璃器皿
植物组织培养工作对玻璃器皿的需要是灵活多样的, 多种器皿都可使用。玻璃器皿最好用硼硅酸盐(即派 热克斯玻璃)材料制造,一般要求溶解度小,其形状 可根据研究工作的目的和要求而定。

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(A) 培养容器
培养用的玻璃器皿要求透光度好,能耐高压蒸汽灭菌。 根据培养目的和要求不同,可采用不同种类和规格的

玻璃器皿。

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①试管 在需要少量培养基进行研究、接种外植体或进 行幼胚培养(如桃幼胚等)的实验中,可以选用试管进 行培养。要求试管口径要大、长度稍短,便于操作,以 2.0cm×15cm、2.5cm×15cm、3.0cm×15cm为宜。
②三角瓶 又叫三角烧瓶和锥形瓶,具有瓶口小,瓶底 大,培养面积大,受光好,易放臵,培养效果好,在植 物组织培养中最常用。接种外植体时多用容积为50mL的 三 角 瓶 , 一 般 实 验 用 100mL 的 三 角 瓶 , 生 产 育 苗 多 用 150mL的三角瓶。近年来,三角瓶在组织培养中的应用愈 来愈广泛,无论是固体培养还是液体培养,都可用三角 瓶。一般用口径2.5cm~3cm的大口径三角瓶较好。

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③果酱瓶或罐头瓶 成本低,瓶口大,操作方便,透 光好,培养材料生长健壮,但培养污染率较高。生产 中应用较多的是200mL的果酱瓶,也有用较大的罐头瓶。 ④培养皿 在无菌材料分离、滤纸灭菌、种子发芽、 病毒鉴定时较常用,其规格有直径6cm、9cm、12cm的。 固体平板培养一般采用直径6cm的小型培养皿。此外, 可以用培养皿室内催芽,以供培养时取材之用。在无 菌室还可以在培养皿中解剖茎尖、分离花粉、切割继 代培养物及其他外植体或培养材料。

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⑤植物组织培养专用容器 这是一种新型组培专用容器, 采用进口高分子PC(俗称太空玻璃)为主要材料生产, 在高压蒸汽灭菌条件下反复使用不破裂、不变形,使用 寿命长,透光率高于玻璃容器。最大的优点是不易破碎, 符合机械化洗瓶要求,利于降低损耗和工厂化生产。
瓶口包扎,以达到防止培养基干燥和杜绝污染的目的。 可用多种方法,通常以纱布包被棉花塞,外边再包一层 牛皮纸,用线绳或橡皮筋捆扎,也可用封口膜、铝箔、 双层硫酸纸、耐高温的塑料纸、耐高温的塑料盖。

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(B) 盛装器皿 盛装容器主要是存放各种试剂和药液。 ①磨口瓶 包括无色和棕色两类,细分为广口瓶、细口 瓶,规格有1000mL、500mL、250mL、125mL,广口瓶用于

存放试剂,细口瓶用来分装配制好的各种母液。不易保 存的母液存于冰箱中低温保存,见光易分解的药品可用 棕色瓶安全保存。
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②滴瓶 盛装一定浓度的酸液或碱液,用于调节培养基 的pH值。其中碱液用塑料滴瓶更好。

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③搪瓷锅(盆)或不锈钢锅(盆) 用于配制和熬制培 养基,研究可用较小的规格,如1000mL规格的搪瓷缸, 或4000mL规格的搪瓷锅,生产上要选较大的规格,如 8000mL或更大规格的不锈钢锅较好,可提高劳动效率。
④烧杯 规格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL, 用于配制各种母液和培养基。

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(C) 计量器皿
计量器皿要求有准确的刻度,以便于在配制各种母液及 培养基时能准确定量,减少实验误差。 ①容量瓶 规格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL, 用于配制各种母液时定容。

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②刻度吸管 又叫移液管,规格有10mL、5mL、1mL、 0.5mL、0.2mL、0.1mL。用于吸取各种母液。 ③量筒 规格有1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL、 25mL 、10mL、5mL,用于配制不同浓度的酒精和配制培 养基时吸取大量元素母液等。 (D)其他 除以上各种容器外,还应具备一些其他玻璃器皿,如漏 斗、称量瓶、玻璃棒等,以便用于培养基的制备等工作。 有条件时,还可以配备培养基分装器,由大型滴管、漏 斗、橡皮管及铁夹等构成。此外,还有量筒式分装器, 上有刻度,下有橡皮管及铁夹控制。微量分装可用注射 器。

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(2)仪器与设备 ①天平 可以根据实际需要配备选择如下称量仪器。天平应 放在干燥,避免震动,无腐蚀性药品的地方,应尽量避免移 动,天平匣内应放硅胶或其他中性干燥剂以保持干燥。 (A) 药物天平称量精度为0.1g,用来称取蔗糖和琼脂等。 (B) 扭力天平 既移动方便,又较为灵敏的称量仪器,可 弥补药物天平和分析天平各自的不足,精度为0.001g,而且 在1g 内的物品不用加砝码,故使用方便。 (C) 分析天平 精度为0.0001g,用来称取微量元素和植 物生长调节物质及微量附加物。选择平稳,干燥,没有腐蚀 性药品和水气的地方放臵天平。

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(D) 电子天平

精度高、称量快、但价格较高。

②冰箱 分普通冰箱和低温冰箱。某些试剂、药品和母 液需低温保存;有些材料需低温处理。一般备有家庭用 冰箱即可。 ③烘箱和恒温箱 洗净后的玻璃器皿,如需迅速干燥, 可放在烘箱内烘干,温度以80~100℃为宜。若需要干热 灭菌,温度升高至150~180℃,持续1~3h即可。在进行培 养物的干重分析时,可在80℃条件下烘干。 恒温箱即可用于植物原生质体和酶制剂的保温,也可用 于组织培养中暗培养。恒温箱内装上日光灯可进行温度 及光照方面的小型实验。

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④显微镜 一般用双目体视显微镜较多,用于剥取茎尖 以及隔瓶观察内部植物组织生长情况。同时也还要有生 物显微镜,用以观察花粉发育时期及培养过程中细胞核 的变化等。此外,倒臵显微镜可以从培养器皿的底部观 察培养物,因此,在液体培养时,可用倒臵显微镜进行 观察。 ⑤酸度计(pH试纸也可) 培养基中的pH值十分重要, 因此,在配制培养基时,需要用酸度计测定和调整。一 般用小型酸度测定仪,既可在配制培养基时使用,也可 测定培养过程中pH值的变化。若不做研究,仅用于生产, 也可用精密pH4~7的试纸来代替。测定培养基pH值时,应 注意搅拌均匀后再测。

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⑥蒸馏水器 水中常含有无机和有机杂质,如不除去, 势必影响培养效果。植物组织培养中常使用蒸馏水或去 离子水,蒸馏水可用金属蒸馏水器大批制备,要求更高 的用硬质玻璃蒸馏水器制备。去离子水是用离子交换器 制备的,成本低,但不能除去水中有机成分。一般生产 性的组培育苗,对水要求不太高,除配制各种母液用蒸 馏水或去离子水外,配制培养基所用水可以用自来水代 替,如果当地水质较硬,可以用煮沸过并沉淀去杂质后 的白开水,以降低生产成本。

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⑦空调器(空气调节器) 夏季高温不利于试管苗生长 繁殖,常常造成组培苗生长不良,或引起玻璃化等不良 反应,需要购臵空调器降温,空调器功率应根据培养室 大小来定。

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⑧超净工作台 如有条件购臵先进设备——超净工作台, 既方便,又舒适,无菌效果又好,它可代替无菌室和接 种箱。超净工作台原系工业用于半导体元件与精密仪器 仪表的装臵,现已成为植物组织培养上最常用、最普及 的无菌操作装臵。它有单人、双人、及三人式的,也有 开放和密封式的。超净工作台一般较宽,购臵和设计房 屋时应注意,以防房门太窄而搬不进去。超净工作台主 要是通过风机,将送入的空气经过细菌过滤装臵,再流 过工作台面。因此超净工作台应放臵在空气干净、地面 无灰尘的地方,以延长使用期。使用过久,引起堵塞, 需要清洗和更换过滤器。

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⑨培养架 进行固体培养和试管苗大量繁殖时,需要有 放臵培养瓶的培养架。制作培养架时应考虑使用方便、 节能、充分利用空间以及安全可靠。架子可用金属、木 材制作,隔板可用玻璃、木板、纤维板、金属板等,最 好用平板玻璃或铁丝网,既透光,上层培养物又不受热。 这里介绍一种效果好、容量大、使用较安全、较适用的 培养架,立柱用直径30 mm左右的钢管,横架用25 mm角 钢焊制而成,灯座装于每层两侧的横架上,其上有槽, 用于固定灯座。每层装40 W日光灯2~3个,镇流器最好装 于室外以利于散热。也可在两端横架下方6~8 cm另装一 横档,其上装灯座和启动器。

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还有一种叫为万能角铁的配件,其长度为3 m,可切割成 不同长度的配件,用于组装培养架。此种培养架可以任 意组装,并且造价较低。 1根万能角铁原料售价一般在20元人民币,1个培养架用 10 根,加上螺丝等小型配件,1个培养架造价在300元以 内,较由其他的原料制成的培养架成本低。 木制和铝制造价和铁制的造价均在500元以上,并且显得 笨重,特别是木制的容易发生火灾。

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⑩灭菌装臵 高压蒸汽灭菌锅是最基本的设备,用于培 养基、器械等的灭菌。有大型卧式、中型立式和小型手 提式等多种,可按生产规模来选用,大型效率高、小型 方便灵活。

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小型手提式有内热式和外热式两种,内热式加热管在锅 内,省时省电,但不能用火炉加热;外热式可用电炉、 煤炉、煤气等加热。

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手提式内热小型高压灭菌锅配一个3 kw调压变压器和定 时钟,可实现半自动灭菌,并省电40%。
此外,应有紫外线灯、水浴锅、室内小推车、振荡培养 机和旋转培养机及其他培养装臵。

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(3)用具和器械 组织培养所需要的用具和器械,可选用医疗器械和微生 物实验所用的器具。常用的用具和设备如下。

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①镊子 小型尖头镊子,适用于摄取植物组织和分离茎 尖、叶片表皮等。长16~25cm的枪形镊子,腰部弯曲,使 用方便,可用于接种和转移植物材料。

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②剪刀 常用的有解剖剪和弯头手术剪,一般用于试管 内剪取茎段,进行继代培养的转接。在剪取外植体时, 特别是木质化程度较高的枝条常用剪枝剪(修枝剪), 在果树组织培养中,枝条修整时也需要修枝剪。 ③解剖刀和芽接刀 常用的解剖刀,有长柄和短柄两种。 刀头也有双面和单面之分,可以经常更换。对大型材料 如块茎、块根等需用大型解剖刀。果树的枝芽常需要芽 接刀。 ④接种工具 包括接种针、接种钩及接种铲,由白金丝 或镍丝制成,用来接种花药或转移植物组织。 ⑤钻孔器 取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时使用。 钻孔器一般做成T形,口径有各种规格。

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⑥细菌过滤器

溶液中有些生长调节物质以及有机附

加物质,如吲哚乙酸等,在高温条件下易被分解破坏, 可用细菌过滤器来除菌。可采用金属制的蔡氏漏斗,以 石棉微孔滤膜(孔径为0.45μm)除去细菌。在过滤较少 量的液体时,宜用醋酸纤维素或硝酸纤维素物质制成的 微孔滤膜,其孔径为0.45μm。这种滤膜在氧气存在下, 能经受125℃高温灭菌。在过滤灭菌时需要一套加压(注 射器)或减压吸滤设备,漏斗下接吸滤瓶,吸嘴处接上
一只内装脱脂棉的滤气玻璃管。

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⑦注射器 普通的皮下注射器头上安装滤板夹,其上有 0.45μm滤板,构成一个微孔滤板微量注射器。可用来过 滤灭菌,也可以用于微量悬滴培养中的营养液的分装。 ⑧其他 灼烧工具用的酒精灯、用于溶解培养基的带有 磁搅拌器的电炉、用于加速溶解大量琼脂培养基的微波 炉、用于贮备无离子水和重蒸馏水的大型塑料桶、试管 架以及转移培养瓶、试管架的搪瓷盘或小铁篮等。

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另外,可以根据培养效果的好坏和成本的高低选用适当 的瓶塞和外罩。一般试管和烧瓶可用未经脱脂的棉花塞 (有时包上纱布或粗布),亦可用泡沫塞子或铝箔塞。 铝箔也用以包裹棉塞和泡沫塞,也可以用能经受高压灭 菌的塑料盖。近年来,有一种透明的、可进行高压消毒 的封口薄膜,既防止污染,又可使空气透过,并有良好 的透光作用。 预先灭菌的或经过高温灭菌的培养器皿也可用帕拉胶片 (parafilm)密封,该胶片是一种蜡制的、不能进行高 温灭菌、可伸展的黏性薄片或胶带。也有只用两三张羊 皮纸或其他纸来包扎瓶口。

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培养基的配制、灭菌及操作技术

植物组织培养成功与否,一方面取决于培养材料本身

的性质,另一方面取决于培养基的种类和成分,所以组 织培养的发展与培养基的改进是分不开的。
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不同的植物材料对培养基的要求不同,因而必须根据

不同的植物材料以及不同的培养目的选择合适的培养 基,并按照不同的培养阶段加入适当的添加物。
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作为主要碳源的蔗糖、支撑物琼脂的浓度及培养基的 pH值都会影响外植体和培养材料的生长和发育。

6.1 培养基的营养及成分
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培养基通常有两个水平(或两个组成部分) 一、是基本培养基,包括大量元素和微量元素(无机 盐类),维生素和氨基酸,还有糖和水等。迄今为止, 基本培养基已有几百种,但较常用的仅一二十种,如 MS、改良MS、White、Nitsch、N6、B5等基本培养基。

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二、是完全培养基,即在基本培养基的基础上,根据 各种不同试验要求,附加一些物质,如添加各种植物 生长调节物质(BA、ZT、KT、2IP、2,4-D、NAA、IAA、 IBA、GA等)以及其他的复杂有机附加物,包括有些成 分尚不完全清楚的天然提取物,如椰乳、香蕉汁、番 茄汁、酵母提取物、麦芽膏等。

(1)水 (2)无机盐
?无机盐是植物生长发育所必需的化学元素。在植物组

织培养时,各种营养物质主要从培养基中获得,如氧、 氢元素从水中得到,矿质元素要靠加入适宜的无机盐 类物质提供。培养基中除了氧、氢、碳有机物外,剩 下的为矿质元素,包括N、P、K、S、Ca、Mg等大量 元素和Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo等微量元素。

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①大量元素 大量元素常占植物体干重的百分之几至万分之几
氮是最重要的。一般用硝态氮或氨态氮。即无机氮在培养基中有两 种供应形式,一种是硝酸盐;另一种是氨盐。当作为唯一的氮源时, 硝酸盐的作用要比氨盐好得多,但在单独使用硝酸盐时,培养基的 pH值会向碱性方向漂移。若在硝酸盐中加入少量氨盐,则会阻止这 种漂移。因此,培养基既含有硝酸盐又含有氨盐为好。 磷对植物的生命活动具有十分重要的作用,缺磷时蛋白质合成降低。 钾、钙、镁、硫等元素能影响植物组织中酶的活性,决定着新陈代 谢的过程。 ②微量元素 主要包括Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo、Co多种微量元素, 用量10-5~10-7mol/L,植物对这些元素的需要量甚微,稍多即会发 生外植体变性、酶失活、代谢障碍等毒害。 微量元素对植物组织的生命活动都有重要作用。如硼促进生殖器官 的发育,影响蛋白质的合成和授粉受精;铜有促进离体根生长的作 用;锰与呼吸作用和光合作用有关。锌是各种酶的构成要素,增强 光合作用效率,参与生长素代谢。

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③Fe盐 对叶绿素的合成与延长生长起重要作用。 铁元素不易被植物直接利用和吸收,通常以硫酸亚 铁和Na2-EDTA(螯合剂)配制成螯合物用于培养基中。
早 期 配 方 中 曾 采 用 过 硫 酸 铁 [Fe2(SO4)3] , 后 又 用 氯 化 铁 (FeCl2)代替硫酸铁,但它们都不是理想的铁供应源。 在根培养时,接种后一周,采用氯化铁的培养基的pH值就由 4.9~5.0偏移到5.8~6.0,根开始表现出缺铁症。与根不同, 愈伤组织由于能分泌与铁离子相结合的天然螯合物,可以在 一定程度上利用铁盐。

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(3)有机化合物
主要包括碳源(也是能源)、维生素类、氨基酸及其他有机附加物。 ①碳源 植物组织在离体之后,由于没有叶绿体或只有发育不好的叶绿 体,基本上不能制造需要的碳水化合物,难以依靠自养作用维持其生存, 必须在培养基中另外加入碳水化合物,它所需要的碳素是以各种糖的形式 提供于培养基中。 糖除了在培养基提供培养物所需的碳骨架和能源外,还可在一定程度上 调节培养基的渗透压。 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸,以糖类物质最为重要。一 般来说,蔗糖是最好的糖源,它具有热易变(heat-liable)的性质,经 高压灭菌后,大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖,只剩下部分的蔗糖,这更 有利于吸收和利用。此外也可以直接利用果糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二 糖等。也有利用多糖类的可溶性淀粉和糊精以及果胶的报道。

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常用的糖浓度为1~5%。糖的浓度不只是对细胞增殖有作用,同时也是影
响细胞分化的因素之一。

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②维生素类 主要以各种辅酶的形式多项代谢活动,对生长分化有一定的作用。 完整植株是能够制造维生素的,但是离体组织却不能合成足够的维生素。
常用的维生素浓度约0.1~1.0mg/L之间。其中盐酸硫胺素(维生素B1 )是绝对需 要的(全面促进植物生长),一般加烟酸(维生素B3)、盐酸吡哆醇(维生素B6) 对根的生长好处。维生素热易变性,易在高温下降解,可进行过滤灭菌,添加肌 醇能改善培养植物的生长状况,在培养基中加入1.0 mg/L的肌醇就足以影响维生 素B1的效应。 加泛酸钙(维生素B5)、生物素(维生素H)以及抗坏血酸(维生素C),但它们 并不是普遍的限制因子。

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③氨基酸 是蛋白质的组成成分,也是一种有机氮源,除构成生物大分子(如蛋白 质、酶等)的基本组成外,还具有缓冲作用和调节培养物体内平衡的功 能,对外植体的芽、根、胚状体的生长、分化有良好的促进作用。

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常用的氨基酸有甘氨酸、酰胺类物质(如谷酰胺、天门冬酰胺)和多种 氨基酸的混合物(如水解酪蛋白、水解乳蛋白)等。
此外还有谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸以及酪氨酸等。

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④天然复合物 天然复合物的成分比较复杂,大多数 含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。 由于其对一些难培养的培养材料有特殊作用,所以在 一些试验中还常常应用它。
常用的天然复合物有椰乳(CM,100-200mL/L)、玉米胚乳、香蕉 汁(150-200mL/L)、马铃薯汁(100-200mL/L)、 、水解酪蛋 白(CH)、水解乳蛋白(LH)、酵母提取液(YE,0.5%)、麦芽浸 出物(ME)、苹果汁等。

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由于它们是天然有机物,其成分往往不一,这些差异 将会影响实验的重复性。

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⑤植物生长调节物质 是培养基中不可缺少的关键物质,虽然用量少,但对外植体愈伤组织诱

导和根芽等器官分化,起着重要和明显的调节作用。影响最显著的植物 生长调节物质主要是生长素类和细胞分裂素类物质。
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生长素类:促进细胞的伸长生长和细胞分裂,被用于诱导愈伤形成,促 进生根。生长素类中的吲哚乙酸(IAA)由于比较容易被氧化而很少使用, 常 用 的 是 二 氯 苯 氧 乙 酸 ( 2,4-D ) 、 萘 乙 酸 ( NAA ) 、 吲 哚 -3- 丁 酸 (IBA)。诱导愈伤组织用2,4-D、NAA,用量:0.1-10mg/L

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细胞分裂素类:可促进植物细胞的分裂和不定芽形成,打破顶端优势形成 丛生芽,有利于芽的增殖,常用于继代和增殖培养。
激动素(KT)、异戊烯基腺嘌呤(2iP)、6-苄基腺嘌呤(BAP)、玉米素(Zt)、 噻重氮苯基脲(TDZ),强弱依次为: TDZ >Zt >2iP >BAP >KT 。

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其它类:赤霉素GA3、脱落酸ABA、多效唑PP333

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(4)培养材料的支持物
为使培养材料在培养基上固定和生长,要外加一些支持物。
琼脂(agar)是使用最为普遍的凝固剂,本身并不提供营养,它是一种 高分子的碳水化合物,从海藻中提取,仅溶于95℃左右的热水,成为溶胶。 通常的用量为0.5-1.0%。加的太多,则培养基过硬;用量太少,则培养基 太软,培养基酸度大或灭菌时间过长时,培养基也发软。 琼脂的质量和纯度不仅对培养基的硬度有影响,而且还会影响培养结果,

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固体培养基所需要设备简单,使用方便,只须可供调控温度及光照的培养
室。但固体培养基只有部分材料表面与培养基接触,不能充分利用培养 容器中的养分,而且培养物生长过程中,排出的有害物质的积累,而造 成自我毒害,必须及时转移。 液体培养基需要转床、摇床之类的设备,通过振荡培养,给培养物提供良 好的通气条件,有利于外植体的生长,避免上述固体培养基的缺点。

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(5) 培养基的pH值
培养基的pH值因培养材料不同而异。大多数园艺植物都要求在pH5.6~5.8 的条件下进行组织培养。

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培养基的pH值的变化会影响到一些离子的溶解度,会使一些溶解度变小 的盐类沉淀,影响到植物对各元素的吸收比例,甚至会出现缺素症。
琼脂培养基的pH值还会影响培养基的凝固情况,一般培养基偏酸时(低 于5.0),培养基凝固较差,需要较多的琼脂才能凝固,反之,培养基偏 碱时(高于6.0),凝固效果好。经高压灭菌后pH值会稍有下降,一般用 1mol/L HCl调低.用1mol/L NaOH调高.

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(6) 其它成分
在培养基中往往因培养目的不同、植物材料不同,而加入一些其它成分。 目前较常见的有活性炭,另外还有抗生素物质、抗氧化剂、诱变剂、生 长抑制剂等。

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6.3 培养基母液的配制
每种培养基往往需要十多种化合物,配制起来很不方便,也很难 达到准确和精确,特别是微量元素和植物生长调节物质用量极少, 很难准确秤量,为了简便起见,将配方中的药品一次称量供一段 时间使用,即配成一些浓缩液,用时稀释,这种浓缩液就是浓缩 贮备液(简称母液)。 如果采用配制母液的方法,不仅可以解决上述问题,而且还可以 减少工作量和便于母液的低温贮藏。

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母液浓缩液是根据培养基配方加大若干倍(一般多为10~200倍), 一般按试剂种类和性质将其分别秤量,分别溶解,分别配制,单 独保存或几种混合保存。 几种试剂混合配制时要按一定顺序将各种溶液混合成一定倍数的 母液,母液浓度为实际应用时浓度的10~200倍,配制培养基时再 按比例吸取即可。
这样配制一次母液,可多次使用,并在配制较多数量的培养基时, 降低工作强度,提高工作效率,也提高试验精度。

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常用的配制母液的方法是将大量元素分别称量后,分别溶解后配成 大量元素母液,微量元素按统一的扩大倍数分别称量和溶解在一起 配制成微量元素母液,铁盐、有机物均需单独配制, 在配制母液时应注意防止产生沉淀。药品应采用纯度等级较高的分 析纯AR(二级)或化学纯(三级),以免带入杂质和有害物质对培 养材料有不利影响。 配制母液要用纯度较高的蒸馏水或去离子水,药品称量、定容都要 准确。 配好后,在容器上贴上标签,注明配制日期、母液倍数和名称。应 臵于2~4℃冰箱中保存,尤其是生长调节物质与有机物更应如此。 基本培养基的四种母液有:大量元素(浓缩20倍);微量元素(浓 缩200倍);铁盐(浓缩200倍);除蔗糖之外的有机物质(浓缩 200倍)。在制备这四种贮备液时,应使每一种成分分别溶解,然 后再把它们彼此混合。现以MS培养基为例进行母液的配制。 (1)大量元素母液 在配制大量元素母液时一定要分别称量,分别溶解,在定容时按表 中的序号依次加入容量瓶中,以防出现沉淀。倒入贮液瓶中,贴好 标签和标好记录后,可常温保存或放入冰箱内保存。

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大量元素母液(配1升20倍的母液) 序号 成分 配方用量(mg/L) 称取量(mg) 1 NH4NO3 1650 33000 2 KNO3 1900 38000 3 KH2PO4 170 3400 4 MgSO4· 2O 370 7H 7400 5 CaCl2· 2O 2H 440 8800

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配1升培养基吸取量50mL

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(2)微量元素母液

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在配制微量元素母液时也应分别称量和分别溶解, 可用蒸馏水,也可用去离子水,定容时不分先后次 序,可随意加入容量瓶中定容,一般不会出现沉淀 现象。倒入贮液瓶中,贴好标签和标好记录后,可 常温保存或放入冰箱内保存。

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微量元素母液(配1升200倍的母液) 成分 配方用量(mg/L) 称取量 (mg) MnSO4· 2O 4H 22.3 4460 ZnSO4· 2O 7H 8.6 1720 H3BO3 6.2 1240 KI 0.83 166 Na2MoO4· 2O 0.25 2H 50 CoCl2· 2O 6H 0.025 5 CuSO4· 2O 5H 0.025 5 配1升培养基吸取量5(mL)

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(3)铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用,只有其螯合物才容 易被植物吸收和利用,因此需要单独配成螯合物母液。目前常 用的铁盐为硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)和乙二胺四乙酸二钠的 螯合物。此螯合物使用方便,又比较稳定,不易产生沉淀。配 制方法为:称取5.57克硫酸亚铁和7.45克乙二胺四乙酸二钠, 分别用450mL的离子水(或蒸馏水)溶解,分别适当加热并不 停搅拌,待分别溶解后,再将两种溶液混合在一起,调整pH值 到5.5,最后加蒸馏水或去离子水定容于1000mL的容量瓶中, 倒入棕色贮液瓶中,贴好标签和标好记录后放入冰箱内保存。

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铁盐母液(配1升200倍的母液) 成分 配方用量(mg/L) FeSO4· 2O 7H 27.8 Na2-EDTA 37.3 配1升培养基吸取量5(mL) 称取量(mg) 5560 7460

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(4)有机物母液 按表中用量分别称取各种有机物,分别溶解后,用 蒸馏水或去离子水定容于1000 mL的容量瓶中,放 入细口瓶中备用,贴好标签和标好记录后臵于冰箱 中低温保存。琼脂、蔗糖等用量较大的有机物质, 不用配成母液,在配制培养基时按量直接称取,随 取随用。

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有机物母液(配1升200倍的母液) 成分 配方用量(mg/L) 称取量(mg) 肌醇 100.0 20 000 烟酸(VB5) 0.5 100 烟酸硫胺素(VB1) 0.1 20 盐酸吡哆醇(VB6) 0.5 100 甘氨酸 2.0 400

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配1升培养基吸取量5 (mL)

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(5)生长调节物质母液 绝大多数生长调节物质不溶于水,可以加热并不断搅

拌促使溶解,必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。各 类植物生长调节物质的用量极微,通常使用的浓度单 位 是 mg/L , 一 般 也 要 配 制 成 母 液 , 母 液 配 制 成 1mg/mL的浓度,即称取100mg生长调节物质,溶解 后用容量瓶定容至100mL。有些药品配制母液时不溶 于水,需要用稀酸、稀碱或酒精溶解。常用的生长调 节物质和有机物的溶解方法如下:

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(A) 生长素类 溶于95%的乙醇或0.1mol/L的NaOH中,用去离子水或 蒸馏水定容,贮于棕色液瓶中,贴好标签后放入冰箱内低温保存。NAA (萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、IAA(吲哚乙酸)、2,4-D(苯氧乙 酸)—般多用少量95%乙醇溶解,然后加热的蒸馏水定容。 (B) 细胞分裂素类 溶于0.5或1mol/L的HCL或浓度小的NaOH中,然 后用去离子水或蒸馏水定容,贮于棕色液瓶中,贴好标签后放入冰箱内 低温保存。KT(激动素)、BA(6-苄基嘌呤)可先用少量1N盐酸溶解, 然后加热的蒸馏水定容。 ZT(玉米素) 先用少量95%乙醇溶解,再用热的蒸馏水定容。 (C) 赤霉素类 赤霉素易溶于冷水,但溶于水后不稳定,易分解,最好 用95%的乙醇配成母液存于冰箱。用时用去离子水或蒸馏水稀释到需要 的浓度。 (6)其他 (A)三十烷醇 取0.1g溶于5mL二氯甲烷中,再加入10mL吐温80,搅拌 至溶解后加蒸馏水至100mL,继续高速搅拌至乳白色,即成0.1%乳液,存 于冰箱中备用。若储存时间过长发生乳析现象,应先猛烈震荡再使用。 (B)叶酸 叶酸需先用少量氨水溶解,用去离子水或蒸馏水定容。

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贮备母液都应贮存于适当的玻璃瓶中,分别贴上标签,标注母液 名称、配制倍数、日期及配制一升培养基时应取的量,母液最好 放臵于冰箱中低温(2~4℃)保存,特别是生长调节物质与有机 物类物质,贮存时间不要太长。 在贮备椰子汁(液体胚乳)的时候,要先把从果实中采集到的汁 液加热煮沸,以除去其中的蛋白质,过滤,然后臵塑料瓶中贮存 于-20℃的低温冰箱内。在使用这些贮备液之前必须轻轻摇动瓶 子,如果发现沉淀悬浮物或微生物污染,必须重新配制。
应当注意的是某些生长调节物质如生长素、玉米素、脱落酸、赤 霉素等以及某些维生素遇热不稳定,不能和其他营养物质一起高 温灭菌,而要进行过滤灭菌。

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每次配制培养基时,吸取母液量(mL)=所配培养基的毫升数/母 液浓度倍数。如果配制1000mL培养基,并且母液浓度倍数为200 倍,则吸取母液量(mL)=1000mL/200倍=5mL

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培养基无机营养研究规律: 成分 配方(mg/L) 分子量 NH4NO3 1650 80 KNO3 1900 101 KH2PO4 170 236 MgSO4·7H2O 370 247 CaCl2·2H2O 440 147 FeSO4·7H2O 27.8 278 Na2-EDTA 37.3 372

摩尔浓度 20mmol 19mmol 1.25mmol 1.5mmol 3mmol 0.1mmol 0.1mmol

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成分 配方(mg/L) 分子量 摩尔浓度 MnSO4·4H2O 22.3 223 0.1mM ZnSO4·7H2O 8.6 288 0.03mM H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CoCl2·6H2O CuSO4·5H2O 6.2 62 0.83 166 0.25 242 0.025 250 0.025 238 0.1mM 0.005mM 0.001mM 0.0001mM 0.0001mM

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6.4 培养基的配制

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(1)培养基配制步骤
配好各种母液后,就可以准备配制培养基了。 配制培养基时可按如下步骤进行,如图。

大量 微量 铁盐 有机物 生长调节剂 蔗糖 琼脂
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加水混合 调节pH值(用1N HCl或1N NaOH)
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加热溶解
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玻璃器皿水洗、干燥

分装

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封口

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高压蒸汽灭菌

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培养基冷却凝固
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培养基存放
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准备接种

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(C) 培养基的分装
将调整好pH值的琼脂培养基要趁热分装到培养容器中,琼脂在 大约40℃时凝固。一般每瓶约40mL左右,塞上棉塞或用封口膜 等封瓶口材料封口,再用线绳或橡皮筋捆扎。及时做好标记。

七 外植体
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(1)外植体种类
从理认上讲,植物细胞多具有全能性,若条件适宜,都能再生成完整植株,任何 组织或器官多能作为外植体。但实际上,植物种类不同,同一植物不同器官、同 一器官不同生理状态,对外界诱导反应的能力及再生能力是不同的。

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A、植物基因型 草本比木本易于组织培养,双子叶植物比单子叶植物易于培养。 B、外植体来源 从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外 植体,离体培养易于成功。对于大多数植物来说,茎尖是较好的外植体,由于茎 尖形态已基本建成,生长速度快,遗传稳定,也是获得无病毒苗的重要途径。也 可以用叶片、茎段、根等。 C、外植体大小 外植体大小应根据培养目的而定,如是胚胎或脱毒培养,易小。如进行快繁易大。 但过大不易灭菌,过小难以成活。一般在0.5-1.0cm为宜。叶片、花瓣5mm2,茎 约0.5mm,茎尖分生组织带一两个叶原基0.2-0.3mm

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(2)植物材料的表面灭菌
A 外植体的灭菌方法 植物生长在大自然中,而在大自然中无时无刻不存在各种微生物,处处都有杂菌滋 生,因此,从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。采来用 于培养的植物材料,不能直接进行培养,必须经过仔细的表面灭菌处理后,获得无 菌材料后才能进行培养。把处理好的材料经无菌操作手续放臵到培养基上,即接种, 接种的植物材料叫做外植体。实践表明,外植体材料来源于不同环境条件下,其带 菌程度不同,灭菌难易程度和灭菌效果有明显差别,采自田间的试材较温室的材料 难,新生嫩芽比老枝梢的芽容易,夏季生长旺盛季节抽出的新芽灭菌效果好,污染 率低。 外植体取材—自来水冲冼---70%酒精表面消毒(20-60S)--无菌水冲冼—消毒剂处 理—无菌水充分冲冼---备用。 第一步是刷洗、冲洗材料。采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分用适当 的软毛刷、毛笔等在流水下刷洗干净,也可以用毛笔沾少量洗衣粉刷洗。然后把材 料切割到适当大小,根据清洁程度的差异,臵于烧杯中,用流水冲洗几分钟至数小 时,细小或易漂浮的材料可用纱布、塑料纱窗或铜丝网笼扎住。 第二步是用洗衣粉或肥皂水浸洗并搅动,洗衣粉可按每100 mL水加1~2角匙的量配 制,即浓度较高为好。大约浸搅1~5min,然后再用自来水冲净洗衣粉,进一步减少 污染。此过程可视外植体具体情况而定,较干净的或容易处理的可以省略此步骤

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第三步是材料的表面灭菌,要在超净台或接种箱内操作。将一干净烧杯(大 小视材料多少而定)或广口瓶内、外表面用70%或80%酒精棉球擦拭作表面灭 菌,臵于超净台(已开机10min以上),再把处理好的植物材料臵入,同时已 准备好了灭菌溶液、无菌水、待用培养基等。工作人员换上洁净的工作服, 戴上帽子。用肥皂洗手至肘部,用洁净毛巾擦干,用70%酒精棉球擦手。在

超净工作台前,附近应放有座钟或表,把沥干的植物材料转放到灭菌过的
烧杯或广口瓶中,看好时间,倒入灭菌溶液,加表面活性剂吐温-80数滴, 在持续灭菌的时间内轻轻摇动广口瓶,以促进植物材料各部分与灭菌溶液 充分接触,驱除气泡,使灭菌彻底。在快到预定时间之前1~2min,即开始

把灭菌溶液倒入另一准备好的大烧杯中,要注意勿使材料倒出。
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倾净后立即倒入无菌水,轻轻摇动。表面灭菌的时间是从倒入灭菌溶液开 始,到倒入无菌水时为止,加以记录,为今后比较灭菌效果,积累经验。 冲洗完毕后,这时的材料就可以接种了。

无菌水冲洗每次3min左右,视采用的灭菌溶液种类不同,一般冲洗3~10次。 另外,要选择适当的灭菌剂。目前市场上供应的一些化学灭菌剂都具有表 面灭菌的作用,而在试剂的选择上与时间长短的处理上则应根据材料对它

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的敏感性来决定。表4-3为常用表面灭均剂使用浓度及效果比较。

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B 灭菌剂及其效果 灭菌剂要求既要有良好的灭菌作用,又要不会损伤外植体材料,或 较少损伤材料,还要易被无菌水冲洗掉或能自行分解,不会遗留在 培养材料上而影响生长。常用的灭菌剂有漂白粉(1%~10%的滤液)、 次氯酸钠液(0.5%~10%)、升汞(氯化汞,0.1%~1%)、酒精 (70%)、双氧水(3%~10%)。其中次氯酸钠能分解产生具有杀菌 作用的氯气而挥发。过氧化氢液会分解产生具有杀菌作用的氧气而 成无害的化合物。升汞有剧毒,对材料的表面灭菌效果好,只是灭 菌后难易除去残留的汞,为此灭菌后要多次冲洗,升汞的毒害作用 不象漂白粉那样可以很快表现出来,一般要经过一段时间培养后才 会表现。 漂白粉是一种有效的杀菌剂,但应避光、干燥保存。70%酒精比其 他浓度的酒精有更强的杀菌能力和穿透力,而且有湿润作用,可排 除掉材料表面的空气,利于其他灭菌剂的渗入,由于酒精穿透力强, 故应严格掌握好处理时间。为了使杀菌剂润湿整个组织表面,还需 在药液中加入润湿剂。常用的润湿剂有吐温(Tueen)80,或吐温 20,可加入数滴或用0.1%的浓度,对组织的湿润有良好的效果。

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常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较 灭菌剂, 浓度(%), 去除, 时间, 次氯酸钙, 9~10, 次氯酸钠, 漂白粉, 溴水, 2, 饱和溶液, 1~2, 易, 易, 易, 易, 5~30, 5~30, 5~30, 2~10, 效果 很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好

过氧化氢, 10~12, 氯化汞, 酒精, 0.1~1, 70~75,

最易, 5~15, 较难, 易, 中, 2~15, 0.2~2, 30~60,

抗生素, 4~50mg/L,

硝酸银,

1,

较难,

5~30,



八、外植体接种与培养

九、 继代培养
组织培养中,培养物(细胞、愈伤组织、器官、试管苗等)培养 一段时间后,为了防止培养的细胞团老化,或培养基成分利用完

而造成的营养不良及过多代谢产物积累毒害等影响,要及时将其
转到新的培养基中,进行继代培养,使培养物能顺利的增殖分化 及生长。

继代培养时间的长短因植物材料不同、培养方法与目的不同而不
同。一般液体培养1周继代一次,固体培养2-4周。

十 植物组织 器官培养技术

一、植物组织培养一般步骤
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阐述植物组织培养的基本过程: (1)准备工作 (2)培养基制备 (3)外植体制备 (4)接种 (5)培养 (6)定期检查 (7)移栽、炼苗

二、愈伤组织培养过程
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诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料,而是培 养条件,其中激素的成分和浓度是最重要的因素。 最常用的生长素是IAA,NAA和2,4-D,使用浓

度范围约在0.01-10mg/L。最常用的细胞分裂素是KT
和6-BA,使用浓度范围在0.1-10mg/L。

(1)愈伤组织的形成
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起动期:外值体(explant)中已分化的活细胞在外源激素的作用下,通过脱 分化的起动期而进入分裂,并开始形成愈伤组织。 特征:外观上虽然未见明显变化,但实际上细胞内一些大分子代谢动态已发 生明显的改变。 脱分化起始期的实质是在外源生长素的诱导下,首先激活了这些细胞中 特定基因表达,为细胞分裂期的DNA复制奠定了基础。 分裂期:是指外植体切口边缘开始膨大,外层细胞开始细胞分裂,形成中间静止 的芯。 特征:细胞核大,核仁明显,可见大量分生组织团的形成;细胞代谢十分活 跃,细胞分裂迅速,形成大量的愈伤组织 分化期:细胞的平均大小基本稳定,不再减少, 细胞分裂由原来的局限在组织外缘的平周分裂转 为组织内部较深层局部细胞的分裂,结果形成瘤 状或片状的拟分生组织,称为分生组织节。成为 愈伤组织的生长中心或进一步分化为维管组织节 —平周分裂形成管胞等。

2 愈伤组织的生长
通过继代培养继续生长

3 愈伤组织的分化和形态发生
在外界条件适宜的情况下,可再分化为芽和根的 分生组织并由其发育成完整植株

叶肉组织 愈伤组织 新植株

杨树愈伤组织

# 生长较好的非洲山 毛豆愈伤组织

三、器官与体细胞发生
?由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径:一种叫做不定器官形成,或叫器

官形成,即在愈伤组织的不同部位分别独立形成不定根或不定芽;另一种叫做体细

胞胚胎发生,即在愈伤表面或内部形成类似于合子胚的结构,称为体细胞胚、不定
胚或胚状体。体细胞胚发生所经历的与合子胚相似,经历球形胚、心形胚、鱼雷形 胚和子叶胚。一般认为愈伤中的不定芽是多细胞起源,而体细胞胚是单细胞起源, 因此体细胞胚发育形成的植株是没有遗传差异的。

根据形态差异可将器官发生与体细胞胚发生区分开来,前者是一种单极性结 构,里面长出的开成层束与原先存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接 在一起。与此相反,体细胞胚是一个双极性结构,胚根的顶端是封闭的。一 般认为,体细胞胚是由单细胞起源的,并且与母体愈伤组织或外植体无维管 束相连。

器官发生途径:
1、先分化芽,待芽伸长后在其幼茎基部长根,形成完整小植株。木本植物中较 为常见,根芽诱导分二步完成。 2、先分化根,再在根上产生不定芽而形成完整植株。

3、在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根,然后两者的统管组织互相连接,成 为具有统一轴状结构的小植株。

体细胞胚发生途径:
1、从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚,中间不经过愈伤组织 阶段;
2、外植体先愈伤化,然后由愈伤组织细胞分化成胚(较为常见)

体细胞胚胎发生
自然界中的胚胎发育是指受精作用完成之后起始于合子有胚胎发生过程。历经 球球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚,最后成为成熟胚。实践证明植物细

胞具有形成胚的能力。体细胞胚是指在植物组织培养中起源于一个非合子胚细
胞,经过胚胎发生和胚胎发育开成胚状结构,称胚状体。 胚状体发生途径是植物组织培养中最好有效的途径之一,同其它发生途径相比, 其特点表现在:1、具有明显的两极性(器官分化中芽和根的形成是单极性) 胚状体具有胚根和胚芽两极性。2、遗传稳定性 胚状体起源于单细胞或细胞团, 在其产生和发育过程中一量形成即通过分化过程,结构稳定,无需长时间的脱 分化与再分化过程,细胞变异的频率较低,成苗率高,遗传稳定性好。3、发

生数量大,增殖率高 胚状体形成后,可在适宜的条件下再生胚状体,即形成
大量次级胚状体。

体细胞胚发生的途径 体细胞胚发生途径大致可分为两类: 直接途径:从外植体某个部位直接诱导分化出体细胞胚 间接途径:外植体先愈伤化,然后由愈伤组织细胞分化成胚 在愈伤组织发生胚状体中,愈伤组织中经常有一种细胞 形态其表现是液泡小、细胞质浓、聚集成团,称为胚胎 发生丛。在胚胎发生丛的表面是高度分化的细胞团,可 产生大量的胚状体。

四、人工种子

(1)定义与结构
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人工种子是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料, 外面还被有特定物质在适宜的条件下可以发育成苗的植物幼体。

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三部分组成:
①人工种皮 是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。薄膜既能允许内外气体 交换通畅,又能防止人工胚乳中水分以及各类营养物质的渗漏。还应该具备一定的

机械抗压力。
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②人工胚乳 是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质,一般以生成胚状 体的培养基为主要成分,再根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药 以及除草剂等物质,尽可能提供胚状体正常萌发生长所需要的条件。

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③胚状体 胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根双极性、类似天然种子胚的
结构,具有萌发长成植株的能力。 通过这样的组合,人为地制造出和天然种子相类似的结构。

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(2)优点
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(1)采用人工种子进行快速繁殖它解决了有些作物品种繁殖能力差、结
籽困难或发芽率低等问题,快速(1L培养基中可产生10万个胚体)繁殖, 便于运输和储藏。 (2)人工胚乳可根据不同植物的要求配制,加入植物激素、有益微生物 或抗病、抗虫成分,有利于农作物抗病虫害,加速作物的生长和发育。这 样使人工种子优越于天然种子,生产效率高。 (3)可以固定杂种优势,加速良种繁育。如果体细胞胚是来源于茎尖培

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养成的愈伤组织,那么这种人工种子可形成“无毒苗”.
(4)可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁。(生物工程产生的转基因

新植株和采用生物技术筛选获得的突变体,可以通过体细胞胚发生制作
人工种子迅速扩大繁殖,又不受季节限制就可以提供充足的种源。) (5)人工种子可大批量生产,具有成本低,发芽速度和生长速度比较一 致,体积小,运输方便,可以直接播种和机械化操作等,提高农业的自动 化程度,节约粮食 。 (6)可保存珍贵品种。

(3)怎样制作?

人工种子制作基本过程
第一步高质量体细胞胚状体诱导
1 选取目标植物 3 愈伤组织增生 2 诱导愈伤组织 4 体细胞胚诱导

第二步 体细胞胚发生的同步化控制 第三步人工胚乳制作
筛选出适合体细胞胚萌发的培养基配方:主要是胚状体发芽生长所需的
无机盐、碳水化合物和蛋白质等营养物质;加入生长因子(例如植物激素 等)、抗生素、防腐剂或农药做成微胶囊。

第四步人工种皮制作
要求:能保持胚状体的活力,利于萌发或贮藏。所选材料要有韧性,耐压, 透气、保水性好,对胚状体无毒害作用,还应含有杀菌剂以防止播种后土 壤微生物的侵染。海澡酸钠、明胶、树胶、琼脂糖、Elvax4260,聚氧乙烯 等

第五步 人工种子包埋

内膜的包埋方法
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一个例子——海藻酸钠包埋: 包埋液(人工胚乳)制备: 2%-3%的海藻酸钠+营养物、生长因子等 将成熟的健康的体细胞胚胎与包被液相混合,然后将其滴入适当浓度的氯化钙溶 液中,经过胶复合作用的造形过程,在20-30分钟内形成内含细胞胚、有一定硬度 的雏形人工种子。

外膜(种皮)的包埋方法
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操作:在人工胚乳外围再加上一层薄的包被物质。 要求: 既要有一定密闭性,保持各种成分不至于流失,又要有适当的通透性, 利于气体交换。 既要有一定坚硬度,起到保护作用,又要保证细胞胚顺利发芽。 目前较好的材料如:聚氧乙烯等聚合物

人工种子

例子:胡萝卜人工种子制作
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种子萌发——幼苗 从幼苗制备外植体:剪取子叶、根等 接种在培养基(MS)上,诱导产生愈 伤组织,分散,悬浮培养获得大量胚 状体 筛选大小均匀的胚状体。

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以海藻酸钠为包埋剂,以1%的氯 化钙为凝固剂,用珠滴法制作人 工种子:

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胚状体+海藻酸钠滴入氯化钙溶液 中,形成小球,20-30MIN后取出, 无菌水冲洗
保存或播种

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体 细 胞 胚

十一 植物脱毒苗的培育

1、脱毒苗培育的意义
存在问题: A、植物被病毒侵染后,造成生长迟缓、品质低劣、产量 大幅度下降 B、病毒通过营养体传递给后代,使危害逐年加重

C、病毒病害不能通过化学杀菌剂和杀菌素防治
意义: A、满足了农作物和园艺植物生产发展需要 B、恢复种性,提高产量、质量 C、丰富了植物病理学的内容 D、绿色食品开发、减少污染、保护环境、促进健康。

2、病毒的侵染与传播
1、病毒的形态:杆状、线状、球状 2、病毒的侵染:不能靠自身的力量主动侵入植物细胞,只能借助外力。通过植物细胞的 微伤或刺吸式口器昆虫的口针,把病毒送入植物体。并在体内增殖。 3、病毒的传播: A、介体传播:

(1)昆虫传播:刺吸式口器,蚜虫为主。
(2)线虫传播:在土壤中,以刺吸习性传播 (3)螨虫传播:刺吸式口器,吸食时要吐出唾液,然后将病毒和细胞液汁一起 吸入。 B、接触传播: (1)自然接触传播:如风雨等促使地上部分接触和根在地下部分接触 (2)液汁接种传播:试验研究中常用接种方法感染植株 (3)人为接触:移苗、整枝等 (4)嫁接与菟丝子“桥接”传播 (5)种子传播 4、植物体内传播:维管系统与胞间连丝

3、脱毒方法
A、热处理法 原理:利用某些病毒受热后的不稳定性、而使病毒钝化, 失去活性。 热水浸泡处理:将剪下的接穗或种植材料,在50℃的热水中浸
泡数分钟或数小时,方法简便。但易使材料受到损伤,到55℃时 则大多植物会被杀死。该方法适合甘蔗、木本植物和休眠芽。

高温空气处理:将旺盛生长的植物在35-40℃条件下生长发育,
处理时间的长短,因病毒种类不同可由数分钟到数周不等。热处理 后要立即把茎尖切下来嫁接到无病毒的砧木上。该方法对活跃生长 的茎尖效果较好,既能消除病毒,又能使寄生植物有较高的存活机 会。 限制:并非所有病毒多对热处理敏感。热处理只对那些 球状病毒或线状病毒有效,对杆状病毒不起作用。

B、茎尖培养脱毒
茎尖培养脱毒原理:病毒在感染植株上分布不一致,即老叶片
及成熟的组织和器官病毒含量较高,而幼嫩的及未成熟的组织和器 官病毒含量较低,生长点(0.1-1.0mm区域)则几乎不含或很少。

茎尖无病毒可能存在的原因:
①在一个植物体内,病毒易于通过维管束系统而移动,但是分生组
织中不存在维管束系统。 ②病毒在细胞间移动的另一个途径是胞间连丝,然而,它的速度很

慢,难以追上活跃生长的茎尖。分生组织分化速度大于病毒传播速
度。 ③在茎尖中存在高水平内源生长素,可以抑制病毒的增殖。

不同植物要脱去病毒所需茎尖大小是不同的。通常茎尖培 养脱毒效果的好坏与茎尖大小呈负相关;与茎尖成活率的

高低成正相关。

茎尖培养脱毒的方法:取材可在春夏两季,选择材料田间生长旺
盛的新梢,摘取2-3cm长,去掉较大叶片,用自来水冲冼。对于多 年生植物可用休眠的顶芽和腋芽。

消毒一般在超净工作台上完成,先把材料浸入70%酒精30s,后用10%
漂白粉上清液或0.1%升汞消毒10-15min,消毒时可上下摇动,使 药液与材料充分接触,最后用无菌水冲冼 3-5次,然后用于剥离

茎尖。去除幼叶和叶原基,切取大小,仅留1-2个叶原基的茎尖分
生组织,立即放入培养基内。 培养基以MS为基本培养基,附加BA0.5-1.5mg/L+NAA0.01-0.05mg/L+

蔗糖30g/L+ 琼脂5.5-7.0g/L。pH值5.8。26-30℃,1500-200LX。
采样—去外叶—剥离茎尖—切取分生组织—茎尖培养— 茎尖再生植株---病毒鉴定—防虫网内繁殖脱毒苗

C、热处理结合茎尖培养脱毒
可取稍大的茎尖进行培养,大大提高茎尖培养的成活率和脱毒率。

D、微体嫁接脱毒
将的茎尖作为接穗,嫁接到试管中培养出来的无菌实生砧木上。

E、抗病毒药制脱毒
培养基中加入抗病毒醚,抑制病毒复制。因病毒种类而有差异。 不能脱除所有病毒,可能产生药害现象,此方法还处于探索阶段。

4 脱毒苗的保存繁殖
脱毒试管苗出瓶后的苗木被称作原原种,一般多在科研 单位的隔离网内保存.原原种繁殖的苗木称作原种,多 在县级以上良种基地保存,由原种繁殖的苗木为脱毒苗 提供给生产单位栽培,原原种和原种保管得好可保存 5-10年。

通常原种的苗木应种植在隔离网室中,防止蚜虫等进入;
栽培床土壤要消毒,环境要清洁;不得种植同种植物和 可互相侵染的寄主植物。

5、植物病毒的鉴定与检测
A.枯斑和指示植物检测法 用感病的植物叶片与少许金刚砂相混,研磨成粗汁液,然后 在指示植物的叶片上蘸取汁液,磨擦供试植物的叶片,经清水清 洗后,臵于室温条件下的温室内待测,2-3d后叶片上会出现局部 坏死灶,即圆形的枯斑,在一定的范围内,枯斑数与侵染性病毒 的浓度成正比。

B、血清学检测法
基本原理是动物受其致病细菌、病毒侵染后,动物体内血液中的 球蛋白发生变化而产生抗体,引起动物产生抗体的物质简称为抗 血清。血清中的抗体能与同系的抗原在体外特异的结合,这一特 性就是血清学测定病毒的基本原理。

C.酶标免疫吸附法(ELISA) 有很多的病毒因其浓度太低或某种抑制剂的干扰,常规血清学方 法检测不出时,此法就显示出独特的优越性。该方法首先将同源 特异抗体吸附在反应器皿底部,加入欲测试的含病毒的样品,病 毒与抗体结合,病毒颗粒被固定,再加入酶标记的特异抗体和酶 的底物,酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度 成正比,用此方法可测定出病毒的浓度。 D、电子显微镜法 E、基因检测技术

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十二、组织培养中常见问题:
问题一、污染的原因和预防措施 (1)细菌污染 ①现象 在培养材料附近出现粘液状物体或混浊的水迹状 痕或出现泡沫的发酵状情况,或在材料附近的培养基中出 现浑浊和云雾状痕迹。特点是菌斑呈粘液状物,一般在接 种1~2 d即可发现。

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②原因 除材料带菌 培养基灭菌不彻底会 操作技术 培养条件 ③防治方法 环境 培养基 严格按操作程序

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(2)真菌污染
①现象 培养基上长霉,一般接种后3~5 d就可发现。霉 的颜色有黑、白、黄等。有时多达10 d才表现颜色和症 状。 ②原因 环境不清洁和空气污染造成的。

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超净工作台的过滤装置失效;
培养用器皿的口径过大, 操作不慎等原因引起;真菌孢子落入瓶内。 ③防治方法 在空气循环过滤装置使空气过滤灭菌或通过紫外线照射 灭菌外, 接种时要严格操作。

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细菌污染

真菌污染

问题二:外植体褐变
褐变包括酶促褐变和非酶促褐变。多酚氧化酶(PPO)是植物体内 普遍存在的一类末端氧化酶,它催化酚类化合物形成醌和水,醌再 经非酶促聚合形成深色物质,对外植体产生毒害,影响其生长与分 化,严重时导致死亡。 防止褐变: 1、选择适当的外植体 2、选择适宜的培养基与培养条件 3、对外植体进行预处理 4、添加褐变抑制剂与吸附剂 5、连续转移

问题三:玻璃化

在植物组织培养时,经常会出现“玻璃

苗”,即试管苗生长异常,叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状,整 株矮小肿胀,失绿皱缩成纵向卷促,脆弱易碎。主要是生理失调或 病变,很难继代培养和扩繁,移栽后很难成活。 玻璃化的原因:尚无定论。与培养基成分(细胞分裂素水平较高)、 弱光照、高湿及透气性差、继代次数增多有关。 解决办法:A、利用固体培养基,增加琼脂浓度,降低培养基衬质势, 造成细胞阻遏。B、适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂,降低 培养基中的渗透势,减少培养基中植物材料可获得的水分,造成水 分胁迫。C、适当降低培养基中细胞分裂素和GA的浓度,增加 Ca,Mg,Mn,K,P,Fe,Cu,Zn等,降低培养基中氨态氮浓度。D、增加自 然光照,加快木质化。E、适当降低温度。E、改变培养容器内的通

风条件。

其茎叶呈半透明状,同时出现茎 叶增生、肥厚,叶反卷。玻璃苗 顶端分生组织相对较小,且缺少 维管束原组织。茎叶细胞体积膨 大,液泡化程度高,胞质稀薄, 核变小,细胞无明显长轴,含水
量显著高于正常苗。

玻璃化苗

各种灭菌方法及其适用范围
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1、干热灭菌法 利用鼓风干燥箱(烘箱)进行烘烤灭菌的方法, 此法适用于各种玻璃器皿和器械的灭菌消毒。方 法是将清冼后的玻璃器皿和器械放入箱内,将箱

温控制在150度,40分钟或120度,120分钟。
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4、过滤灭菌 培养基配制过程中,如遇一到某些化学物质,经 高温高压而易于分解减效或失效的可以采用细菌 过滤器进行过滤灭菌。此法适于液体培养基和蒸 馏水的灭菌,不同的材料,需用不同的过滤膜。 (一般在0.3-0.45微米范围)。 5、药制灭菌 利用70%-75%酒精,0.1%-0.2%升汞(氯化汞), 10%的次氯酸钠,饱和漂白粉上清液等药制灭菌 的方法。主要用于培养材料的灭菌。 6、烧灼灭菌 用酒精灯烧灼以达到灭菌的目的,此法主要用于 器械、瓶口、等。 7、照射灭菌 用紫外线照射灭菌的方法。主要用于接种室和台 面的消毒灭菌,在试管受精时可以用于花粉的灭 菌。紫外线照射时间一般为15-20分钟,但在接 种操作时应关闭紫外灯。

2、湿热灭菌法 利用高压蒸汽灭菌的方法,此法用于培养基、蒸 馏水、各种器械、包头纸等,高压灭菌锅的压力 调至121kPa,维持在20-30分钟,一般培养基灭菌 掌握在121kPa压力,20分钟,无菌蒸馏水、器 械等为121kPa,30分钟等。

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3、熏蒸灭菌 利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。此法用于接种 和培养室的灭菌。如向甲醛内加入高锰酸钾,促 进甲醛的快速挥发,防止植物中毒死亡,用量应 尽量少。

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参考书:
1 曹孜义等.果树花卉无毒苗快繁技术.甘肃:甘肃科学技 术出版社,1998

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2 曹孜义等.实用植物组织培养技术教程.甘肃:甘肃科学 技术出版社,1996
3 陈正华等..木本植物组织培养及其应用.北京:高等教育 出版社,1986 4 陈振光等.园艺植物离体培养学.北京:中国农业出版社, 1996

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5 陈振光.果树组织培养.上海:上海科学技术出版社, 1987
6 陈维伦等.植物生物技术.北京:科学出版社,1987

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7 崔澄等.经济植物的组织培养与快速繁殖.北京:农业 出版社,1985
8 桂耀林等.植物组织培养.北京:科学出版社,1985

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9 李浚明.植物组织培养技术教程.北京:中国农业大学 出版社,1992
10 罗士韦等.经济植物组织培养.北京:科学出版社, 1988 11 裘文达.园艺植物组织培养.上海:上海科学技术出 版社,1986 12 沈惠娟.木本植物组织培养技术.北京:中国农业科 技出版社,1992

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13 谭文澄等.观赏植物组织培养技术.北京:中国林业出版社, 1991 14 奚元龄等.植物细胞培养手册.北京:农业出版社,1992 15 谢启昆等.药用植物组织培养.上海:上海科学技术出版社, 1986 16 颜昌敬.植物组织培养手册.上海:上海科学技术出版社, 1990

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17 杨增海.园艺植物组织培养.北京:农业出版社,1987
18 张丕方等.植物组织培养与繁殖上的应用.上海:上海教育 出版社,1985

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19 中国科学院上海植物生理研究所细胞室.植物组织培 养和细胞培养.上海:上海科学技术出版社,1978 20 21 李云主编.林果花菜组织培养快速育苗技术.北京: 周维燕主编.植物细胞工程原理与技术.中国农业大 中国林业出版社,2001

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学出版社,2001

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