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基因工程的基本条件-载体系统


宋 苏轼《桃花》

生物技术专业核心课程

基因工程
淮阴师范学院 高清松

4 基因工程的基本条件 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体

C 用于基因转移的受体菌或细胞

第二节 基因工程的载体系统
一、克隆载体 载体的功能及特征 质粒载体

噬菌体载体 粘粒载体 人工染色体载体

(一)载体的功能及特征
?载体的概念
载体: 在基因克隆中携带外源基因进入受体细 胞的基因工程“运载工具”称为载体。载体的 化学本质是DNA。目前基因工程中使用的载体 多为经过改造的质粒DNA。

?载体应具备的基本特性:
1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性);

2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;
3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;

4.具有较高的外源DNA的载装能力;
5.具有合适的筛选标记。

(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
?质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子;

?质粒常见于原核细菌和真菌中;
?绝大多数的质粒是DNA型的; ?绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分

子结构,即cccDNA;
?质粒DNA的分子量范围:1-300 kb。

2. 质粒的分类
? F质粒:又叫F因子或性质粒,它们能使寄主染色体上的
基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞。

? R质粒:通称抗药性因子,它们编码有一种或数种抗菌
素抗性基因,并且能够将此抗性转移到缺乏该质粒的适 宜的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

? Col质粒:即所谓产生大肠杆菌素因子,它们编码有控
制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不

带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

3. 质粒的基本特性
(1)自主复制

(2)不相容性
(3)转移性 (4)编码性状

(1)自主复制
?质粒DNA上都含有一个复制起始区,控制着质粒在 宿主细胞内的复制,这一复制起始区称为“复制子”。 一般一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。 ?不同质粒在宿主内复制的程度相差较大,体现在单 个细胞内的质粒拷贝数上,最多的可高达700个/细胞, 最低的在每个细胞中只维持有一个质粒分子。

?拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’ 5’ RNA I

复制方向
5’ 3’

ori (+)

rop Rop

E.coli ColE1 plasmid

?按复制能力可将质粒分为两种类型:
? 严紧型(Stringent plasmid):
低拷贝数的质粒,每个宿主细胞中仅含有1-3个质

粒分子

? 松弛型(Relaxed plasmid):
高拷贝数的质粒,每个宿主细胞中可含高达10-60

个质粒分子

(2)质粒的不相容性
?质粒的不相容性(Plasmid incom-patibility):
在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不 同质粒,不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现 象,又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质 粒。 ?不相容性的质粒组成不相容性群,目前,在大肠杆 菌质粒中至少已鉴定出了30个以上的不亲和群。

(3)质粒的转移
?质粒的接合转移
接合型质粒:能在自然条件下自发地从一个细胞转移 到另一个细胞(接合作用),如F、Col、R质粒等; 非接合型质粒:不能在自然条件下独立地发生接合作 用如Col、R的其它成员。

性须

?质粒的迁移作用
质粒的迁移作用(Mobilization):非接合型的质粒 由于分子小,不足以编码全部转移体系所需要的基因, 因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一 种接合型的质粒,它们通常也是可以被转移的。这种 由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过

程,如ColE1质粒。

(4)编码性状
?野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记 基因,这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性 状。 ?物质抗性:抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有

机物; ?物质合成:抗生素、细菌毒素、有机碱。
?这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。

4. 质粒载体的构建
? 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数
低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷,不

能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生
型质粒为基础进行人工构建。

? 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由
少数几个野生型质粒构建的。

? pSC101:8.8 kb,拷贝数5,四环素抗性标记基
因 Tcr

? ColE1:6.5 kb,拷贝数20-30,大肠杆菌内毒素
标记基因 E1

? RSF2124:ColE1衍生质粒,氨苄青霉素抗性标
记基因 Apr

?多克隆位点(Multiple Cloning Sites, MCS)
?在质粒载体内引入适宜的限制性核酸内切酶位

点,以方便外源DNA片段的插入。 ?现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密
集排列的系列克隆位点,称为“多接头”、“限制

酶切位点库”或“多克隆位点”。

?标记基因(Marker Gene)
?按其用途可将标记基因分为选择标记基因和 筛选标记基因。 ?选择标记基因用于鉴别目标DNA(载体)的存 在,将成功转化了载体的宿主挑选出来;

?筛选标记基因可用于将携带了外源DNA片段的
重组子挑选出来。

?选择标记基因
1.氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin resistance gene, ampr) 2. 四环素抗性基因(Tetracycline resistance gene, Tcr) 3. 氯霉素抗性基因(chloramphenicol resistance gene, Cmr) 4. 卡那霉素基因(Kanamycin resistance gene, Kanr)

?筛选标记基因
?筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组 质粒,当一个外源DNA片段插入到一个质粒 载体上时,可通过该标记来筛选插入了外源 片段的质粒,即重组质粒。

??互补
lacZ lacZ’

b
b-半乳糖苷酶的b-肽段

?
b-半乳糖苷酶的?-肽段

b b

?
?

b-半乳糖苷酶

MCS

lacZ’

b b
CH 2 OH HO H OH H H OH H H N O O Cl Br

? ?

b-半乳糖苷酶的?-肽段

Cl Br

O N

N Cl

Br

5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal

5-溴-4-氯靛蓝

? 在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段,
其中含有b-半乳糖苷酶基因(LacZ)的调控序列

和前146个氨基酸的编码序列; ? 在这一编码区中插入有一个多克隆位点,它并
不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶 的氨基端,而不影响功能; ? 宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主 和质粒编码的片段各自都没有酶活性,但它们可以融

为一体,形成具有酶学活性的蛋白质,这种互补现象
叫?互补(?-complement)。

? 由?互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTG(异丙基 硫代半乳糖苷)的存在下可与生色底物X-gal(5-溴-

4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷)反应,因此Lac+细菌在
含X-gal和IPTG的培养基上可形成蓝色菌落,易于识 别。 ? 当外源片段插入到质粒的多克隆位点后,产生无?互补 能力的氨基端片段,因此,带有重组质粒的细菌形成白

色菌落。

? 人工构建的质粒类型:
? 高拷贝质粒:突变拷贝数控制基因,拷贝数
1000-3000,扩增基因;

? 低拷贝质粒:来自pSC101,拷贝数小于10,表
达某些毒性基因;

? 温敏质粒:在不同温度下表现出拷贝数、整合
等不同性质;

? 测序质粒:含有测序通用引物互补序列和多酶
接头polylinker;

? 整合质粒:装有整合促进基因及位点,便于外源
基因的整合;

? 穿梭质粒:由人工构建的具有两种不同复制起始
点和选择记号,可在两种不同的寄主细胞中存活
和复制的质粒载体。

? 表达质粒:装有强化外源基因表达的转录、翻译、
纯化的元件;

? 探针质粒:装有报告基因,便于启动子等元件的克
隆筛选;

5. 重要的大肠杆菌质粒载体
?第一阶段:pSC101和ColE1应用较多,但相对分子 量大且酶切位点少; ?第二阶段:pBR322出现后,通过调整载体的结构, 工作效率大大提高;pUC质粒去掉了多余的片段,

添加了多克隆位点和筛选标记等;
?第三阶段:在此基础上,又增加了辅助功能,形成

了表达载体和穿梭质粒等功能性质粒。

?pBR322:
?4363bp; ?松弛型复制,50100拷贝/cell; ?30多个单一位点; ?具有Tcr和Apr; ?用于基因克隆
ROI P vu I P st I Ap
r

E coR I C la I P st I H in d III B am H I

Tc

r

S al I

pBR322 4363 bp
B al I ROP

O rig in o f R e p lic a tio n

H in d II

?pUC18/19:
E coR I S s tI KpnI S m aI B am H I XbaI S a lI P s tI SphI H in d III

?分子量2686bp; ?装有多克隆位点 (MCS); ?Rop基因缺失, 500-700拷贝/cell;

GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452

la c Z '

pUC18
2686 bp Ap
r

o ri

?正选择颜色标记 lacZ’; ?用于基因克隆和测序。

?pGEM-3Z/4Z:
?拷贝数 2000-3000/cell ?装有多克隆位点(MCS) ?正选择颜色标记 lacZ’ ?装有两个噬菌体的强启动子 ?用于外源基因的高效表达

lacZ’ PT7 MCS pGEM-3Z Apr 2743 bp PSP6

ori

6. 质粒DNA的分离与纯化
氯化铯密度梯度离心法

?质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙
锭污染 沸水浴法 ?质粒DNA纯度底、快速、操作简便 碱溶法

?质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶
法之间

氯化铯密度梯度离心法

?用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体
?加溶菌酶裂解细菌细胞壁 proteins

?加CsCl和溴乙锭 ?超速离心过夜
?在紫外灯下吸取cccDNA

ocDNA L-DNA
cccDNA RNAs

?稀释沉淀cccDNA

碱溶法 ?在pH值在12.0-12.5之间时,线

性染色体DNA片段会被变性,而闭
合环状的质粒的DNA则不会被变性 或只有少量的氢键断裂;当恢复中 性pH值时便会迅速地复性。
L-DNA

D-DNA ocDNA cccDNA

?但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确,也不迅

速,因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变
性的蛋白质及RNA一起沉淀下来,而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。

沸水浴法
?用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体; ?加溶菌酶裂解细菌细胞壁; ?沸水浴40秒钟; ?离心,用无菌牙签挑去沉淀物; ?乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA;

(三) ?噬菌体载体(? Bacteriophage)
1.噬菌体的一般生物学特征
?噬菌体或病毒是一类非细胞微生物,能高效

率、高特异性地侵染宿主细胞,然后或自主
复制繁殖,或整合入宿主基因组中潜伏起来,

而且在一定的条件下上述两种状态还会相互
转化。

?噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能
被开发成为基因工程的有用载体,因为: ?高效率的感染性能使外源基因高效导入受 体细胞; ?自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞 中高效扩增;

?大肠杆菌的λ噬菌体生物结构
?λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体; ?λ噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成;

?λ-DNA全长48502个核苷酸;
?λ-DNA上至少有61个基因;

COS

3’

CCCGCCGCTGGA5’
3’

5’TCCAGCGGCGGGG

COS

溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因

cos

头部合成基因

阻遏基因 早期控制基因
阻遏基因 重组基因 删除与整合基因

?-DNA
尾部合成基因

?λ噬菌体生物学特性:感染周期
E.coli
裂解

吸附 注入 复制

包装

?λ噬菌体生物学特性:感染周期
100个左右的拷贝

包装范围为原DNA的75-105% 体内包装

即36-51kb

?λ噬菌体生物学特性:溶原状态
?λ噬菌体感染大肠杆菌后,除能裂解细胞外,也
可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上,

并不产生子代噬菌体颗粒,这种情况为溶原状态;
?整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活,而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞

本身的性质; ?人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质,
使噬菌体或处于溶原状态,或处于溶菌状态; ?DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。

2.λ-DNA载体的构建 ?缩短长度
?野生型λ-DNA包装的上限为51kb,本身长度为 48.5kb,只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb

时,才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。
?因此缩短野生型λ-DNA的长度,可以提高装载

量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复
制和裂解所非必需的。

?根据切除的多少,可将λ-DNA分成两大类载体: 插入型载体
?具有一个限制性内切酶位点。

取代型载体
?具有成对的限制性内切酶位点,在两个位
点之间的DNA区段可以被外源DNA片段取代。

?插入型载体
插入位点 体外包装

载体长度 37kb

插入片段大小: 0-14kb

插入片段

体外包装

(51–37Kb)

?取代型载体
载体长度 26kb 插入片段 最小装载长度 10kb
插入片段 体外包装

体外包装

最大装载长度 25kb
(51 – 26Kb)

?删除重复的酶切位点
?野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII

位点,不利于重组操作,必须删除至1-2个;
?同时,为了便于各种来源的DNA片段的克隆,还需要 增加一些单一的酶切位点; ?除了简单的切割外,还需要采用定点突变技术去除或 增添酶切位点。

?加装选择标记
?与质粒不同,野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记, 因此,加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容;

?λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类: 免疫功能类标记 颜色反应类标记

?选择标记 imm434
?imm434基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌

循环的阻遏物;
?含有完整标记基因的λ-载体进入受 体细胞后,建立溶原状态,细菌生 长缓慢,形成浑浊斑; ?当外源DNA插入到标记基因中,基因

失活,λ-重组分子便进入溶菌循环,
形成透明斑;

?加装选择标记 lacZ
?lacZ基因编码b-半乳糖苷酶,能催化无色的X-gal 生成蓝色化合物; ?当外源基因插入到lacZ基因中,

基因失活,不能合成蓝色化合物; ?而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑。

?Spi-正选择型载体
?野生型的λ噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌

中繁殖(Spi+),这种生长抑制表型受λ-DNA上的red
和gam两个基因控制。 ?若将外源DNA取代red和gam,重组噬菌体便拥有 Spi-表型,能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌 中繁殖,并形成透明斑。

?构建琥珀密码子的突变体
?琥珀型突变(sup)是指由CAG(Gln)向UAG(stop)

的突变。
?将野生型λ-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的 CAG密码子突变成UAG。

?当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后,不能合成
有活性的头部蛋白,也就不能被包装和裂解细菌,这样 就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散,而基因工程 实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌 株。

3.λ-DNA重组分子的体外包装
?外源DNA插入到?噬菌体载体后,需将重组DNA分子
导入宿主细胞中。 ?转染的效率较低(105-106colony/ug ?-DNA),重组

DNA分子的转染效率更低(103-104colony/ug ?-DNA);
?采用体外包装技术,把重组DNA分子包装成成熟的噬

菌体颗粒,便可按正常的噬菌体转导过程导入宿主细
胞中,可明显提高?噬菌体的转染效率,可达107左右。

?λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的
噬菌体重组颗粒,方可高效导入受体细胞; ?用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体 的大肠杆菌中提取,现已商品化。 ?这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分:一部 分缺少E组份,另一部分则缺少D组份。包装时,当

且仅当这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后,
包装才能有效进行。

? ?噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定

限度的,控制在野生型?-DNA长度的75%-105%之间。
在这一范围内的DNA可被包装成有活性的?噬菌体颗 粒,而超出了这个范围的就不能形成正常大小的噬 菌斑。 ? 包装限制说明?噬菌体载体克隆外源DNA的能力不 是无限的,有一个极限值。

4.用λ噬菌体进行克隆
?λ噬菌体载体属于克隆载体,主要用于克隆DNA 片段。构建cDNA文库和基因组文库,并从中筛选目 标基因是λ噬菌体载体一般用途,也可用于亚克 隆在大容量载体(如粘粒)中增殖的外源DNA片段。 ?在构建基因文库时,不同的重组噬菌体DNA经过 裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑。 ?这些噬菌斑的集合,就构成了基因文库。而质粒 载体构建的文库是以菌落的形式存在的。

5.λ-DNA及其重组分子的分离纯化
将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期;

加入λ噬菌体或重组λ噬菌体的悬浮液,37℃培养1小时;
用新鲜培养基稀释,继续培养4-12小时。密度已达1013 -1014/L,大肠杆菌细胞已完全裂解; 超速离心,沉淀噬菌体; 苯酚抽提,释放λ-DNA; 乙醇或异丙醇沉淀λ-DNA。

6.λ-DNA作为载体的优点
λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒,能高效转染大肠杆菌; λ-DNA载体的装载能力为25kb,远远大于质粒的装载量; 重组λ-DNA分子的筛选较为方便; 重组λ-DNA分子的提取较为简便;

λ-DNA载体的适合克隆和扩增外源DNA片段,但不适合表达。

(四)大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
1.M13噬菌体的生物学特性
? 生物结构
M13噬菌体的外型呈丝状; M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成; M13噬菌体不裂解宿主细胞,但抑制其生长; M13 DNA全长6407个核苷酸; M13 DNA上至少有10个基因。 2700个外壳蛋白分子

? 感染周期
(+)DNA II V -DNA RFDNA

+DNA

RFDNA

2.M13噬菌体的构建
III VI I IV II X V VII IX VIII

野生型M13RF-DNA

III VI

I

IV

II

X V VII

IX VIII

M13mpn系列载体 polylinker lacZ‘

3.M13噬菌体的特点
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞 外,这在DNA定向突变中非常有用; M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细 胞生长缓慢,形成混浊斑,易于辨认挑选。而且重 组分子越大,混浊斑的混浊度亦越大; 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小,只有1.5kb;

基因间区段 (507bp)

II

I

(五)考斯质粒和噬菌粒
?λ-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb 和1.5kb,但在很多情况下,往往需要克隆更大的外源 DNA片段,考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一 步提高噬菌体DNA的装载量。
?在包装上限固定的条件下,大幅度缩短噬菌体DNA的长 度,就能同步增加载体的装载能力。 ?将噬菌体DNA与包装有关的序列和质粒组装在一起,既 能最大限度地缩短载体的长度,同时又能保证重组DNA分 子在体外仍被包装成有感染力的颗粒,这便是构建考斯 质粒和噬菌粒载体的思路。

1.考斯质粒(cosmid)载体的构建
?考斯质粒是一类人工构建的含 PstI r 有λ-DNAcos序列和质粒复制子的 Ap 特殊类型的载体; ?1978年Collins和Hohn发明构 建1.8kb的λ-DNA片段+pBR322 片段; ori
?装载范围为31-45kb。
BamHI Tcr SalI pHC79

6400 bp

λfragment
cos

2.考斯质粒的特点
能像λ-DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞;
能像质粒那样在受体细胞中自主复制;

重组操作简便,筛选容易;
装载量大(45kb)且克隆片段具有一定的大小范围; 不能体内包装,不裂解受体细胞。

3.噬菌粒的特点(phagemid or phasmid)
?噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、 复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊 类型的载体。 能像M13-DNA那样体外包装,并高效转染受体细胞; 能像质粒那样在受体细胞中自主复制;

装载量比常规的M13mp系列要大很多(10kb);
通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA; 重组操作简便,筛选容易。

?重要的噬菌粒载体
pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG
M13-IG pUC118 / 119 3200 bp lacZ’ MCS lacI ori

500 个拷贝

Apr

表示M13辅助噬菌体DNA

?pUC118/pUC119噬菌粒载体的优点:
? 具有小分子量的cccDNA,可克隆高达10kb的外源DNA片 段,并易于进行体外分离与操作;

? 编码有一个Ampr基因作选择标记,便于转化子的选择;
? 拷贝数高,每个寄主细胞可高达500个;

? 含有一个常用的多克隆位点,具有?-互补;
? 具有质粒与噬菌体的复制起始点; ? pUC118与pUC119的多克隆位点方向彼此相反,可用它 们制备克隆基因的正或负链DNA; ? 可直接对克隆的DNA进行测序分析。

pBluescript :体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7
f1-ori lacZ’ PT7 MCS pBluescript Apr PT3

噬菌体启动子PT3和PT7强化外 源基因的转录; 提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存在下, 又可实现外源基因的体外转录
2958 bp

ColE1-ori

ori

?pBluescript phagemid的结构特征:
? 源生于pUC和M13载体 ? 在多克隆位点两侧存在一对T3和T7噬菌体的启动子,用 以定向的指导外源DNA或基因的转录; ? 同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来 自ColE1质粒的复制起点,可按不同的复制形式合成出 单链或双链DNA; ? 含有一个Ampr基因作选择标记,便于转化子的选择; ? 拷贝数高,每个寄主细胞可高达500个; ? 含有一个常用的多克隆位点,具有?-互补; ? 可直链对克隆的DNA进行测序分析。

(六)人造染色体载体
?人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克 隆数百甚至上千kb的DNA片段,此时考斯质粒和噬菌粒 载体的装载量也远远不能满足需要。 ?将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配 区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体。 当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后,便形 成重组人造染色体。 ?它能像天然染色体那样,在受体细胞中稳定的复制 并遗传。

1.细菌人造染色体
(Bacterial Artificial Chromosomes BAC) ?细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的 基础上构建的,其装载量范围在50-300kb之间; ?各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一 拷贝; ?pBACs主要适用于: 克隆大型基因簇(gene cluster)结构;

构建动植物基因文库。

2.酵母人造染色体(Yeast Artificial Chromosomes YAC)
?YAC载体应含有下列元件:
?酵母染色体的端粒序列; ?酵母染色体的复制子; ?酵母染色体的中心粒序列; ?酵母系统的选择标记; ?大肠杆菌的复制子; ?大肠杆菌的选择标记;
TRP1

ARS1

CEN4 EcoRI

Apr

pYAC4

URA3

?YAC载体的装载量为350-400kb。 TEL

ori

BamHI

TEL

二、表达载体
?在研究中经常需要获得大量蛋白质,以便深入开展 下一步的工作。

?通过生物化学手段提取和纯化蛋白是一件费时费力、 而且效果欠佳的方法,甚至有时是不可能的。
?在得到目的蛋白的编码基因后,使基因进行超量表 达,能够高效分离纯化蛋白质,这样得到的蛋白质产 物既可以满足精确的实验要求,也可以用于蛋白质产 品的生产。

?作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求。即 能将外源基因运载到受体细胞中,其基本骨架是最简单 的质粒克隆载体中的复制起点和抗生素抗性基因; ?在基本骨架的基础上,增加表达元件,就构成来表达 载体。

(一)启动子(Promoters)
? 启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合,从而起始

基因转录的一段DNA序列,通常位于基因上游;

? 启动子本身并不控制基因活动,它就像“开关”一样,

通过与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因 子的相互作用,从而控制基因转录的起始时间和表达

的程度。

?启动子的筛选
采用鸟枪法战略,将合适大小的DNA片段克
隆到启动子探针质粒pKO1上;
Apr

受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上 报告基因galk的表达产物联合作用,可将培养 基中的半乳糖酵解成红色素物质。 转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆 ori

pKO1

galK

?启动子最佳距离的探测
A

目的基因

E

E

目的基因 E E 启动子

A 酶切开

Bal31酶解

?启动子的构建
T82T84G78A65C54A45 T80A95t45A60A50T96

启动子 PL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac T T T T T T

-35 区序列 T T A T T T G G G G T G A A A A A A C T C C C C A A A A A A G T T T T T

-10 区序列 A A A T A A T T A A T T A A T A A A C A G C A A T T T T T T

?启动子的可控性
?乳糖启动子Plac的可控性:
?野生型的Plac与其控制区Olac

基底水平转录 阻遏蛋白

偶联在一起,在没有诱导物 存在时,整个操纵子处于基 底水平表达;
?诱导物可以使启动子Plac
半乳糖苷(IPTG)

P
乳糖 异丙基-β-D-硫代

O
诱导

介导的转录大幅提高。 P O

高效转录

?乳糖启动子Plac的可控性:
cAMP
?野生型的Plac上游附近拥有
CAP

高效转录

代谢激活因子(CAP)结合 区,cAMP激活CAP,CAP 结合启动子控制区,进而促 进Plac介导的转录。
?葡萄糖代谢使cAMP减少,

Plac
葡萄糖代谢

O
cAMP浓度降低 基底水平转录

也能阻遏Plac介导的转录。因 此,基因工程中使用的乳糖 启动子均为抗葡萄糖代谢阻 遏的突变型,即Plac UV5。

Plac

O
高效转录

Plac UV5 O

?色氨酸启动子Ptrp的可控性:
?色氨酸启动子Ptrp受色氨酸阻遏蛋白

色氨酸

基底水平转录

阻遏蛋白复合物的阻遏,转
录呈基底状态;
?在培养系统中去除色氨酸或

Ptrp
除去色氨酸

Otrp
或加3-吲哚丙烯酸 (IAA)
高效转录

者加入3-吲哚丙烯酸(IAA), 便
可有效地解除阻遏抑制作用;
?在正常的细菌培养体系中,除

Ptrp

Otrp
高效转录

去色氨酸是困难的,因此基因
工程中往往添加IAA诱导Ptrp 介导的目基因的表达。 Ptrp Otrp

??噬菌体启动子P?L的可控性:
?噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白

阻遏作用
目的基因

阻遏,很难直接诱导控制。在基P trp 因工程中常使用温度敏感型的cI
突变基因cI857控制PL。
?cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落,

cI857
A

PL
B

PL便可介导目的基因的表达.
?但在大型细菌培养罐中迅速升温 Ptrp

色氨酸

表达

PL
A B

非常困难,因此常使用一个双质粒
控制系统,用色氨酸间接控制目的 基因表达。

(二)终止子(terminator)
1. 强化转录终止的必要性
?外源基因在强启动子的控制下表达,容易发生转录 过头现象,即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质 粒上邻近的DNA序列,形成长短不一的mRNA混合物; ?过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的 表达。

? 转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间

就相应增加,外源基因本身的转录效率下降;
? 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功

能区域,如选择性标记基因和复制子结构等,则RNA聚合酶 在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能,甚至导 致重组质粒的不稳定性;
? 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌

无谓的能量消耗;
? 更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结

构,从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。

2. 强终止子的选择与使用
?目前外源基因表达质粒中常用的终

终止子序列

止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上 的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf;
?对于一些终止作用较弱的终止子,
Tcr

通常可以采用二聚体终止子串联的特

Apr

pCP1

殊结构,以增强其转录终止作用;
?终止子也可以象启动子那样,从细
ori 筛选Apr、Tcs的转化子

菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。

(三)核糖体结合位点(ribosome binding site)
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率,而且在很大程度上还与mRNA的翻译 起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA 分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达 数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序

列所决定,称为核糖体结合位点(RBS)

1. 核糖体结合位点的四个特征结构要素结构
?Shine-Dalgarno(SD)序列;
?翻译起始密码子及其后续若干密码子;

?SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。
?基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列;

2. 核糖体结合位点对外源基因表达的影响
? SD序列的影响:
?Shine-Dalgarno(SD)序列:位于翻译起始密码子上游的6-8个

核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合, 将mRNA定位于核糖体上,从而启动翻译;
?一般来说,mRNA与核糖体的结合程度越强,翻译的起始效率就

越高,而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补 性,其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言,上述 四个碱基中任何一个换成C或T,均会导致翻译效率大幅度降低 。

?SD序列与起始密码子之间的序列的影响:
?SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU,翻译效率最高;

而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和

25%。
?紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响,对于

大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言,在这个位置上最佳 的碱基组合是UAU或CUU,如果用UUC、UCA或AGG 取代之,则酶的表达水平低20倍。

?SD序列与起始密码子之间的距离的影响:
?SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在

核糖体上定位后,翻译起始密码子AUG正好处于核糖体

复合物结构中的P位,这是翻译启动的前提条件。
?在很多情况下,SD序列位于AUG之前大约7个碱基处,

在此间隔中少一个碱基或多一个碱基,均会导致翻译起

始效率不同程度的降低。

?起始密码子及其后续若干密码子的影响:
?大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三

种起始密码子,但其识别频率并不相同,通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。 除此之外,从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要,至

少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构,否则便
会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位;
?目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上,均含有与

启动子来源相同的核糖体结合位点序列,序列和间隔是最佳的。

(四) 密码子(codon)
1. 生物体对密码子的偏爱性
?不同的生物,甚至同种生物不同的蛋白质编码基因,

对简并密码子使用频率并不相同,具有一定的偏爱性。

?偏爱密码子的决定因素:
? 生物基因组中的碱基含量:在富含AT的生物(如单链DNA噬菌

体fX174)基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高;而 在GC丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G或C的简

并密码子占90%以上的绝对优势。
? 密码子与反密码子相互作用的自由能:性中等强度规律 ? 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少; ? 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多; ? 细胞内tRNA的含量

2. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响
?由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率

具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳 动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码 子的正确选择。
?一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在

大肠杆菌细胞中获得最佳表达: 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因

?外源基因全合成
?按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律,设计更换外源

基因中不适宜的相应简并密码子,重组人胰岛素、干
扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了 这种方法。

?同步表达相关tRNA编码基因
?对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率

较高、而本身分子量又较大的外源基因而言,则选择
相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。

? 例如,在人尿激酶原cDNA的412个密码子中,共含有22

个精氨酸密码子,其中7个AGG、2个AGA,而大肠杆菌受
体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。
? 为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达,将

大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高效表达的 质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用。

(五)质粒拷贝数
1. 质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
?目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌

细胞中可达数百甚至上千个拷贝,质粒的扩增过程通常
发生在受体细胞的对数生长期内,而此时正是细菌生理 代谢最旺盛的阶段。
?质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势

必会影响受体细胞的生长代谢,进而导致重组质粒的不 稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。

2. 质粒扩增时序的控制
?pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 ?在28℃时,每个细胞的质粒拷贝数为60
?在42℃时,拷贝数迅速增至300 - 600 ?在此温度下,受体细胞染色体上的
PL MCS

CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失
Apr 活。因此,用一种手段同时控制质粒

pCP3

ori

拷贝数和基因的表达

第三节 用于基因转移的受体菌或细胞
受体细胞应具备的条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体

一、受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷(recB-,recC-,hsdR-) 重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞(recA-) 具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染,生物武器除外

二、各种基因工程受体的特性
(一)大肠杆菌
? 遗传背景清楚,载体受体系统完备,生长迅速,

培养简单,重组子稳定;
? 编码结构复杂、种类繁多的内毒素; ? 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的

高效表达、基因文库的构建,是DNA重组实验和基 因工程的主要受体菌。

(二)枯草杆菌
? 遗传背景清楚,蛋白质分泌机制健全 ,生长迅

速,培养简单,不编码内毒素;
? 遗传欠稳定,载体受体系统欠完备;
? 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白

多肽的有效分泌。

(三)链霉菌
? 抗生素的主要生产者,分子遗传相对操作简便,

不产内毒素;
? 遗传不稳定,生长相对缓慢;

? 主要用于抗生素生产菌株的改良。

(四)酵母菌
? 具有真核生物的特征,遗传背景清楚,生长迅速,

培养简单,外源基因表达系统完善,遗传稳定;
? 内源性蛋白产物种类繁多且含量高;
? 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的

高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控 的研究,是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受 体菌。

(五)昆虫细胞(家蚕)
? 具有真核生物的特征,外源基因表达量高,繁殖

相对较快,培养成本低廉,遗传稳定;
? DNA重组操作系统欠完善;

? 适用于真核生物基因的高效表达。

(六)哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞CHO)
? 与人的亲缘关系近,分子重组表达系统健全,具

有合适的糖基化修饰系统;
? 细胞培养条件苛刻,生长缓慢; ? 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基

因药物的生产,是DNA重组实验和基因工程的主要哺 乳动物受体。

(七)植物细胞(拟南芥菜、烟草)
? 农作物的经济意义重大,转基因植物细胞易于分

化,细胞培养简单且成本低廉,具有光合作用;
? 遗传操作繁琐;
? 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物

的生产,农作物品质的改良。

三、实验室常用的基因工程受体
大肠杆菌
? 用于接受质粒:C600、W3110、HB101、JM83、

JM101(Aps、Tcs、Cms) 用于接受λ-DNA:LE392、ED8654;

酵母菌
? 毕赤酵母 ? 啤酒酵母

哺乳动物细胞(CHO)

?本节要点
1. 概念 质粒 严紧型质粒 接合型质粒 质粒的迁移作用 α-互补 松弛型质粒 非接合型质粒 质粒的不相容性 噬菌粒

考斯质粒

穿梭质粒

2. 简答 1) 质粒的基本特性 2) λ-DNA作为载体的优点 3) 考斯质粒的特点 4) 噬菌粒的特点


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