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专题78 PCR技术的基本操作和应用


专题 78 PCR 技术的基本操作和应用
【基础回顾】

考点一、PCR 原理 DNA 热变性原理,即:

考点二、PCR 反应过程 (1)变性:当温度上升到 90_℃以上时,双链 DNA 解聚为单链。 (2)复性:温度下降到 55_℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。 (3)延伸:温度上升到 72 ℃左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在 DNA 聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。

【技能方法】

1.细胞内 DNA 复制与 PCR 技术的比较

2.PCR 的反应过程 (1)变性:当温度上升到 90 ℃以上时,双链 DNA 解聚为单链,如下图:

(2)复性:温度下降到 50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结 合,如下图:

(3)延伸:温度上升到 72 ℃左右,溶液中的四种脱氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作用 下,根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链,如下图:

3、PCR 扩增易错点 (1)DNA 分子复制的人工控制 解开螺旋:在 80~100 ℃时,DNA 双螺旋打开,形成两条 DNA 单链,称为变性。 恢复螺旋:在 50 ℃左右时,两条 DNA 单链重新形成双螺旋结构,称为复性。 复制条件:缓冲液、DNA 模板、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶和两种引 物。 反应场所:PCR 仪。 (2)PCR 技术中的引物: ①含义:引物是一小段单链 DNA 或 RNA 分子。 ②作用:为 DNA 聚合酶提供合成的 3′端起点。 ③种类:扩增一个 DNA 分子需要 2 种引物。 ④数目:引物数目等于新合成的 DNA 子链数目。 ⑤与 DNA 母链的关系: 两种引物分别与 DNA 母链的 3′端通过碱基互补配对结合。

【基础达标】

1.PCR 技术控制 DNA 的解聚与结合是利用 DNA 的( A.特异性 C.热变性 B.稳定性 D.多样性



【答案】C 【解析】 DNA 分子在 80~100 ℃的温度范围内变性,双链解开成单链,当温度慢慢降低时, 又能重新结合形成双链。故选 C。

2.引物的作用是( A.打开 DNA 双链 B.催化合成 DNA 子链



C.使 DNA 聚合酶能够从引物的 3′端开始复制 D.提供模板 【答案】C 【解析】 DNA 分子的复制具有方向性,即只能从子链的 5′→3′方向进行复制。当引物 与 DNA 母链结合后, DNA 聚合酶就能从引物的 3′端开始延伸 DNA 链。 所谓 3′、 5′ 是指脱氧核糖上 C 原子的位置。选 C。

3.下列关于 PCR 引物的说法,不正确的是(



A.引物是 PCR 过程中与模板 DNA 部分序列互补,并能引导模板 DNA 的互补链合成的 核苷酸序列 B.引物常根据需要扩增的目标 DNA 的碱基序列用化学合成的方法获得 C.DNA 聚合酶只能使 DNA 链从引物的 3′端开始向引物的 5′端延伸 D.引物的 3′端必须具有游离的—OH 【答案】C 【解析】 A 项正确:所述是引物的特点和作用; B 项正确:引物是 RNA 或单链 DNA 片段,它能与母链的一段碱基互补配对,因 此可根据扩增目标 DNA 的碱基序列用化学方法合成; C 项错误:DNA 聚合酶使 DNA 链从引物的 5′端向引物的 3′端延伸; D 项正确:DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的 3′端末端的羟 基上,形成磷酸二酯键。

4.下列操作过程的叙述中错误的是(



A.PCR 反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行 高压蒸汽灭菌 B.PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存 C.PCR 所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化 D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的吸液枪头都必 须更换 【答案】C 【解析】 A 项正确:为了防止外源 DNA 等因素的污染,PCR 反应中所用的微量离心管、枪 头、缓冲液及蒸馏水等,在使用前要进行高压蒸汽灭菌; B 项正确:PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存; C 项错误:在使用前,将 PCR 所需试剂从冰箱内拿出来,放在冰块上缓慢融化; D 项正确:使用一次性吸液枪头。

5.PCR 技术扩增 DNA,需要的条件是( ①目的基因 ②引物



③四种脱氧核苷酸 ④DNA 聚合酶等 ⑤mRNA A.②③④⑤ C.①②③④ 【答案】C 【解析】 PCR 技术需要目的基因作为扩增的模板,DNA 聚合酶催化反应的进行,而引物是 满足 DNA 聚合酶起作用的需要,四种脱氧核苷酸是该过程的原料。故选 C。 ⑥核糖体 B.①②③⑥ D.①③④⑤

【能力提升】

1.多聚酶链式反应(PCR 技术)是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法,由高温变

性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的 DNA 得以迅速 扩增,其简要过程如图所示。下列关于 PCR 技术叙述不正确的是( )

A.PCR 技术是在实验室中以少量 DNA 制备大量 DNA 的技术 B.反应中新合成的 DNA 不能作为下一轮反应的模板 C.PCR 技术中以脱氧核糖核苷酸为原料,以指数方式扩增 D.应用 PCR 技术与探针杂交技术可以检测基因突变 【答案】B 【解析】 A 项正确:PCR 技术是一项在生物体外复制特定 DNA 的核酸合成技术; B 项错误:PCR 技术需要模板 DNA,且反应中新合成的 DNA 又可以作为下一轮复 制的模板; C 项正确: PCR 的原理就是 DNA 的复制, 原料是脱氧核糖核苷酸, PCR 技术使 DNA 以指数的方式扩增,即约 2n; D 项正确:应用 PCR 技术与探针杂交技术可以检测基因突变。

2.DNA 扩增过程中 DNA 片段经若干次扩增,其数目理论值变化应与下图中曲线相符 的是( )

【答案】C 【解析】 DNA 在扩增过程中呈指数式增长,即一个 DNA 分子连续扩增 n 次,理论上所产

生的 DNA 分子数为 2n 个。故选 C。

3.PCR 仪实质上是一台自动调控温度的仪器,它调控不同温度的目的是( ①95℃,使 DNA 分子变性,失去生物活性 ②95℃,使 DNA 分子变性,解开螺旋 ③55℃,使 DNA 分子开始复制、延伸 ④55℃,使 DNA 分子恢复双螺旋结构,恢复活性 ⑤72℃,使 DNA 分子开始复制、延伸 ⑥72℃,使 DNA 分子恢复双螺旋结构,恢复活性 A.①③⑤ C.②④⑤ 【答案】C 【解析】 B.②③⑤ D.②④⑥



PCR 利用了 DNA 的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解旋与结合。PCR 仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。①错误②正确:当温度上升至 95℃时, DNA 分子变性,解开双螺旋结构;③错误④正确:温度下降到 50℃左右(55℃),引 物与 DNA 单链结合,DNA 恢复双螺旋结构,恢复活性;⑤正确⑥错误:温度上升至 72℃,DNA 分子开始复制、延伸,根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。故选 C。

4.PCR 技术又称聚合酶链式反应,现在已成为分子生物学实验室的一种常规手段, 它可以在体外很短的时间内将 DNA 大量扩增。你认为下列符合在体外进行 PCR 反应 条件的一组是( ) ②DNA 模板 ④四种脱氧核苷酸 ⑥DNA 解旋酶 ⑧温控设备 B.①②③④⑤⑥⑦⑧ D.①②③④⑤⑧

①稳定的缓冲液环境 ③合成引物 ⑤ DNA 聚合酶 ⑦限制性核酸内切酶 A.①②③④⑤⑥ C.③④⑤⑥⑧ 【答案】D 【解析】

在 PCR 技术中, 需要的条件有模板、 引物、 脱氧核苷酸、 耐高温的 DNA 聚合酶, 此外还需要适宜的温度和 pH(即稳定的缓冲液环境),故选 D。

5.从 2001 年初到现在,青岛某实验基地已孕育出上百只转基因克隆羊,它们的体 内分别携带包括 β —干扰素、 抗凝血酶素、 乙肝表面抗原在内的多种药用蛋白基因。 这意味着,它们可以通过产奶的方式源源不断地提供药用蛋白基因,其应用前景非 常光明。在其实验研究过程中,经常利用 PCR 技术制取大量的有关药用蛋白基因来 供实验用。下列有关 PCR 技术的叙述中,不合理的是( )

A.PCR 扩增反应中加人引物的作用是结合在模板 DNA 上,提供 DNA 延伸起始位点 B.DNA 聚合酶的作用是从引物的 5'端开始催化 DNA 链的延伸。 C.PCR 技术依据是 DNA 的热变性原理 D.PCR 的反应过程一般经历三十多个循环,每次循环都包括变性、复性、延伸 【答案】B 【解析】 在 PCR 中引物能结合在模板 DNA 上,提供 DNA 延伸起始位点,故 A 正确;DNA 聚合酶的作用是从 3'端开始催化 DNA 链的延伸,故 B 错;PCR 技术的依据是 DNA 的 热变性原理,每次循环包括变性、复性和延伸,故 CD 均正确。

【终极闯关】

1.(2015 届江苏省四市调研)利用 PCR 技术将某小段 DNA 分子扩增 n 代,需(双 选)( )

A.测定 DNA 分子两端的核苷酸序列,以便设计引物对 B.2n-1 对引物参与子代 DNA 分子的合成 C.向反应体系中加入解旋酶、DNA 聚合酶等 D.保持反应体系温度恒定,确保扩增的正常进行 【答案】AB 【解析】 利用 PCR 技术将某小段 DNA 分子扩增,必需测定 DNA 分子两端的核苷酸序列, 以便设计引物对,才能按照碱基互补配对原则合成子链,A 正确;DNA 分子扩增 n

代以后,共合成了 2n 个 DNA 分子片段,除起始的两条模板链以外,其它链上都含有 引物,所以共有 2n-1 对引物参与子代 DNA 分子的合成,B 正确;PCR 过程中利用高 温解旋, 不需要向反应体系中加入解旋酶, C 错误; PCR 包括三个阶段, 即高温解旋、 低温复性、中温延伸,所以反应体系温度不恒定,D 错误。

2.(2015 届安徽省蚌埠市高三检测)下列有关生物工程与技术的叙述不正确的是 ( )

A.PCR 技术可用于目的基因的获取 B.选择单核居中期向单核靠边期过渡的花粉进行离体培养成功率高 C.在以尿素为唯一碳源的培养基上长出的菌落一定是尿素分解菌 D.“三北防护林”建设中,应遵循协调与平衡原理和物种多样性原理 【答案】C 【解析】 PCR 可以用于外源目的基因的大量扩增,故 A 正确。在花粉选择进行离体培养 时应选择单核靠边期的成功率高,故 B 正确。在以尿素为唯一碳源的培养基上长出 的菌落有可能是尿素分解菌也有可能是以氮气为主的细菌,还要加入酚红指示剂进 行鉴别, 故 C 错误。 “三北防护林”建设中, 应遵循协调与平衡和物种多样性原理, 故 D 正确。

3. (2015 届江苏省高三下学期第二次统考)如图表示细胞内 DNA 复制和细胞外 PCR 扩增两个过程,两反应过程的条件中相同的是( )

A.模板 C.酶 【答案】B 【解析】

B.原料 D.能量供应

选项 A 模板不同,胞内 DNA 复制以整个 DNA 分子作为模板,PCR 扩增却以一段目

的 DNA 作为模板。选项 B 原料相同,均以 4 种脱氧核苷酸为原料。选项 C 酶不相同, 胞内 DNA 解旋需要解旋酶,延伸需要 DNA 聚合酶等;胞外 PCR 扩增通过高温解旋而不 需要解旋酶,延伸只需热稳定的 Taq 酶。选项 D 能量供应不同,胞内 DNA 复制过程由 ATP 提供能量,而 PCR 扩增主要由外界供能。

4.(2015 届江苏省扬州市高三月考)在 PCR 扩增 DNA 的实验中,预计一分子 DNA 经过 30 次循环后,应该得到 230 个 DNA 分子,但是结果只有约 210 个 DNA 分子,那 么不是出现该现象的原因是( )

A.Taq DNA 聚合酶的活力不够,或活性受到抑制 B.系统设计欠妥 C.循环次数不够 D.引物不能与亲链结合 【答案】D 【解析】 PCR 扩增没有得到应有的 DNA 分子数,有可能是 TaqDNA 聚合酶活性不够或活性 受抑制,可能形成的 DNA 少,故 A 正确。系统设计欠妥会导致达不到预期的结果, 故 B 正确。循环次数不够会出现子代 DNA 分子数少,故 C 正确。引物与亲链不能结 合的情况下不会出现子代,而不是少,故 D 错误。

5.(2013 江苏卷?22)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过 敏反应,为了克服这个缺陷,可选择性扩增抗体的可变区基因 (目的基因)后再重 组表达。下列相关叙述正确的是(双选)( )

A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列 B.用 PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 C.PCR 体系中一定要添加从受体细胞中提取的 DNA 聚合酶 D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞 【答案】BD 【解析】 设计引物时应当与表达载体两端的序列进行互补配对 A 错误; PCR 法扩增目的基因只需要知道基因两端的序列设计合适的引物即可,而不必

知道其全部序列,B 正确; PCR 中应用耐高温的 DNA 聚合酶 C 错误; 根据目的基因的编码产物选择合适的受体细胞, 以有利于基因的表达, D 正确, 因此答案为 BD 。


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