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一株苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性


  环境污染与防治   30 卷   2 期   第 第 2008 年 2 月

(1. 南京师范大学化学与环境科学学院 ,江苏

   摘要

菌株 AN4 。生理生化试验鉴定菌株 AN4 为金黄杆菌属 ( Chryseobacteri um s p . ) 。菌株 AN4 利用苯胺生长和降解苯胺的最适温度 为 30 ℃、H 为 7. 0 ,它可在苯胺质量浓度低于 3 000 mg/ L 的无机盐固体培养基上生长 。菌株 AN4 除可降解苯胺外 ,还可以苯酚 、 p 苯甲酸 、 硝基苯 、 、 、 、 甲苯 萘 氯苯 二甲苯作为唯一碳源生长 ,蛋白胨可加速其对苯胺的代谢 。代谢机制研究证实 ,菌株 AN4 在邻苯二 酚 1 ,22双加氧酶作用下经邻位裂解途径降解苯胺 。

   关键词

210097 ; 2 . Col le ge of Geological S cience , N anj i n g N orm al U ni versit y , N an j i n g J i an gs u 210097)

   苯胺是一种重要的化工原料 ,广泛应用于国防 、 印染 、 、 塑料 油漆 、 农药和医药工业等 。苯胺也是严 重污染环境和危害人体健康的有害物质 ,是一种 “三 在工业排水中要求严格控制 。

致” 物质 ,被列入 “中国环境优先控制污染物名单” ,    在水体和土壤中 , 苯胺主要是在微生物的作用

下进行生物降解 ,降解速率受微生物活性 、 环境条件 ( 温度 、 湿度 、 H 、 p 有机质含量等 ) 等因素的影响 [ 1 ] 。 目前 ,对苯胺降解菌已经开展了一些研究工作 ,筛选 到了多株苯胺降解菌 [ 225 ] ,[ 6 ]215 。苯胺降解菌对苯胺 的耐受质量浓度可达到 5 000 mg/ L [ 7 ] , 也可于 48 h 内将初始质量浓度为 1 000 mg/ L 的苯胺废水降解
80 %以上 [ 8 ,9 ] ,苯胺降解菌的降解极限质量浓度理论

上可达到 0. 025 mg/ L [ 10 ] 。为研究受苯胺污染的水 体和土壤的修复 , 笔者分离得到了高效降解苯胺的 菌株 ,并研究了该菌株的特性 、 生长条件和对苯胺的 降解能力 。

?12 ?

# 第一作者 : 张逸飞 ,男 ,1975 年生 ,硕士研究生 ,主要从事环境微生物和生物化学方面的研究 。 通讯作者 。 3 国家计委 、 教育部 “十五” 工程重点学科建设项目 ( No . 211 ECMS) ; 中国科学院知识创新工程重要方向项目 ( No . kzcx22yw2408) 。 211

logical and p hysiological characteristics. 30 ℃ and p H of 7. 0 were best fo r bot h t he growt h of AN4 and it s degrada2 tion of aniline. AN4 grew in t he medium wit h less t han 3 000 mg/ L of aniline. Besides aniline , AN4 utilized p henol , nit ro benzene , benzoate , toluene , nap ht halin , chlo robenzene and dimet hylbenzene as t he sole so urce of carbo n fo r it s chol 1 ,22dioxygenase as confirmed by t he st udy of metabolism mechanism. growth. Peptone enhanced it s degradatio n of aniline. Aniline was degraded t hro ugh ort ho2cleavage pat hway by cate2 Keywords :   aniline ; metabolism ; catechol 1 ,22dioxygenase ; Chryseobacteri um s p .

sludge o riginated f rom a Nanjing chemical plant . AN4 was classified as a Chryseobacteri um s p . based o n it s morp ho2

Isolation and characterization of aniline2degrading bacterial strain AN4  Zhang Yi f ei 1 , Gu Ting1 , W ang Guoxi ang 2 ,

Zhong Wenhui 1 . ( 1 . College of Chemist ry and Envi ronmental Science , N anj ing N ormal Universit y , N anj ing J iangsu

Abstract :  The highly efficient aniline degrading bacterial st rain AN4 was isolated f ro m acclimated activated

一株苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性 3
张逸飞1 顾 挺1 王国祥2 钟文辉1 #
南京 210097 ;2. 南京师范大学地理科学学院 ,江苏 苯胺 代谢 邻苯二酚 1 ,22双加氧酶 金黄杆菌属

南京 210097)

为研究苯胺污染的生物控制 ,通过驯化培养 ,从南京化工厂污水处理厂的活性污泥中分离出一株高效苯胺降解菌 —— —

1  材料与方法 1. 1

苯胺降解菌株富集 、 分离纯化和鉴定

   从南京化工厂污水处理厂取活性污泥 , 添加苯 胺驯化后分离苯胺降解菌株 ( 以下简称菌株) 。根据 文献 [ 11 ] 对分离到的菌株进行形态观察和生理生化 试验 ,再根据 《伯杰氏细菌鉴定手册》 鉴定其属 。
1. 2

培养基

   牛肉膏蛋白胨固体培养基 ( L A ) : 牛肉膏 10 g ,

蛋白胨 10 g ,NaCl 5 g ,水 1 000 mL ,p H 7 . 2 ; 无机 盐液体培养基 ( MS) 配方按文献 [ 12 ] ; 无机盐固体 培养基则在 MS 上再添加琼脂 2 % ( 质量分数 ) ; 富 集培养基配方按文献 [ 13 ] ; 模拟废水母液配方按文 献 [ 14 ] 。 1. 3 菌株生长量和生理生化指标测定    将菌株先接种于富集培养基中 ,测定 600 nm 处 的浊度 ,以 OD600 表征菌株生长量 。    生理生化指标测定参照文献 [ 11 ] , 测定项目包

张逸飞等   一株苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性

括氧化酶 、 过氧化氢酶 、 甲基红 ( M R) 、 2P 试验 、 V 硫 化氢 、 明胶液化 、 葡萄糖氧化发酵 、 淀粉水解 、 乳糖发 酵和蔗糖发酵等 。 1. 4 菌株降解苯胺能力测定    将菌株先接种于富集培养基中 , 稀释到 OD600 为 0. 8 ,以 3 % ( 体积分数) 的量接种 。苯胺浓度按照 《水质 苯胺类化合物的测定 N2 ( 12萘基) 乙二胺偶氮 ( 分光光度法》 GB 11889 - 89) 测定 。
1. 5

2  结果与讨论

菌株的筛选   在无机盐固体培养基上初步筛选得到 6 株菌 株 ,编号菌株 AN1~ AN6 ,其中菌株 AN1 ~ AN5 为
2. 1

细菌 ,菌株 AN6 为青霉 。经测定 ,菌株 AN4 对苯胺 的降解效果较好 ( 见图 1) 。

菌株对苯胺耐受能力测定    使用 MS 和 L A , 加入不同浓度 、 经过滤除菌的

苯胺 ,28 ℃ 培养 48 h ,观察菌株生长情况 。 1. 6 菌株对抗生素和重金属的敏感性    L A 中分别加入氨苄青霉素 100 mg/ L 、 在 金霉 素 50 mg/ L 、 红霉素 50 mg/ L 、 卡那霉素 80 mg/ L 、 庆大霉素 50 mg/ L 、 青霉素 50 mg/ L 、 硫酸汞 0. 01
mg/ L 、 硫酸银 0. 025 mg/ L 、 硫酸铜 1 mg/ L 、 硫酸镍 1 mg/ L 、 氯化锰 1 mg/ L ,接入菌株后于 28 ℃ 培养 4 2. 2

图1  菌株的筛选 Fig. 1   Aniline degradatio n curves

~7 d ,观察菌株生长情况 。 1. 7 菌株 16S rDNA 扩增及序列测定   菌株经扩培后用缓冲液 ( 0. 15 mol/ L NaCl + 0. 1 mol/ L 乙二胺四乙酸 ,p H 8. 0 ) 洗涤 。DNA 提 取和纯化方法参照文献 [ 11 ] ,16S rDNA 的 PCR 扩 增方法参照文献 [ 6 ] , 所用引物为通用引物 Pf ( 5 ’ ) A GA GT T T GA TCA T GGC TCA G3 ’ 和 Pr ( 5 ’ ) TAC GGT TACC T T GT TAC GAC T T3 ’ , 分别对应 大肠杆菌 16S rDNA 基因的 8227 碱基和 149521514 碱基 。PCR 产物测序由上海英骏生物技术公司完 成 ,同源性检索利用 NCB I 数据库 。 1. 8 菌株的双加氧酶种类的确定    将菌株在含邻苯二酚的 MS 中培养 2 d ,离心分 离细胞 ,用 20 mmol/ L 磷酸钠缓冲溶液 (p H 7. 0 ) 洗 涤 2 次 。破碎细胞采用超声波细胞破碎机或加溶菌 酶 0. 5~1. 0 mol/ L 于 37 ℃ 下振荡 30 min ,分离细 胞溶解产物 。用高效液相色谱法测定粘糠酸和 22羟 基粘糠酸半醛 [ 15 ,16 ] 。
鉴定项目 菌株 AN4 阴性 球状 周生 无 无 金黄杆菌 阴性 球状 周生 无 无 鉴定项目 氧化酶 革兰氏染色 菌落形态 鞭毛染色 芽孢 荚膜 过氧化氢酶
V2P 试验

表1  菌株 AN4 和金黄杆菌微生物生理特征和生理生化鉴定结果 Table 1   rp hological characteristics of AN4 and Ch ryseobacteri um t aichun gens Mo
菌株 AN4 阳性 阳性 阴性 阴性 阳性 金黄杆菌 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 鉴定项目 淀粉水解 明胶液化

甲基红 硫化氢

菌株鉴定    菌株 AN4 菌落黄色 ,为革兰氏阴性杆菌 。除个 别生理生化指标 ( V2P 试验 、 淀粉水解 、 葡萄糖氧化 发酵 、 乳糖发酵) 外 , 其生理生化指标和微生物生理 特征与金黄杆菌 ( Ch r yseobacteri um) 基本一致 ( 见表
1 ) 。进一步对菌株 AN4 的 16S rDNA 进行 PCR 扩

增 并 对 扩 增 DNA 测 序 , 结 果 显 示 该 菌 株 的 16S rDNA 序列与金黄杆菌的16S rDNA 序列的相似 性为 99. 9 % , 故 将 该 菌 株 鉴 定 为 金 黄 杆 菌 属 ( Ch ryseobacteri um s p . ) 。目前 ,已知的可降解苯胺 的微生物还包括粪产碱杆菌 、 诺卡氏菌 、 莫拉氏菌 属、 弗拉特氏菌 、 缺陷假单胞 、 恶臭假单胞菌 、 假单胞 [ 17 ] 菌、 乙酸钙不动杆菌 、 黄色单胞菌等 。 唯一碳源条件下菌株 AN4 的生长量   MS 中 , 苯胺初始质量浓度分别为 500 、 000 、 1 2 000 mg/ L 时菌株 AN4 的生长量见图 2 。由图 2 可 见 ,在苯胺初始质量浓度为 500 、 000 mg/ L 时 , 菌株 1 AN4 分别在 24 、 h 达到最大生长量 , 并且在前 16 32
2. 3

小时内 ,前者浓度中的生长速度较快 ; 菌株 AN4 在苯 胺初始质量浓度为 1 000 mg/ L 时具有较大的生长

菌株 AN4 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性

金黄杆菌 阴性 阳性 阳性 阳性 阴性

葡萄糖氧化发酵 乳糖发酵 蔗糖发酵

?13 ?

  环境污染与防治   30 卷   2 期   第 第 2008 年 2 月

量 。同时 , 菌株 AN4 也可以苯酚 、 苯甲酸 、 硝基苯 、 甲苯 、 、 、 萘 氯苯 二甲苯作为唯一碳源 ( 以相同摩尔浓 度 ,5 mmol/ L ) 生长 ,但生长量均没有以苯胺为底物 时的高 ( 见图 3) 。

图2  苯胺初始质量浓度对菌株 AN4 的生长量影响 Fig. 2  Effect of t he initial aniline concent ratio n on t he growt h of AN4 图4  温度 、 对菌株 AN4 降解苯胺的影响 pH Fig. 4  Effect s of temperat ure and p H o n AN4 degradation of aniline

图3  菌株 AN4 以不同底物为唯一碳源的生长量 Fig. 3  Growt h curves of AN4 using different subst rates as t he sole so urce of carbo n

影响菌株 AN4 降解苯胺的因素分析 2. 4. 1   温度 、 H p
2. 4

图5  苯胺初始质量浓度对菌株 AN4 降解苯胺的影响 Fig. 5  Effect of t he initial aniline concent ration on AN4 degradation of aniline

   调整菌株 AN4 降解苯胺的温度为 15 ~ 35 ℃,
p H 为 5~11 ,在 L A 上 ,考察温度 、 H 对菌株 AN4 p

降解苯胺过程中有较强的抑制作用 , 而蛋白胨和硫 酸铵均能加速苯胺的降解 。SC HU KA T 等[ 18 ] 报道 了提 供 葡 萄 糖 时 , 红 球 菌 株 ( R hodococcus s p . ) 不能促进其对苯胺的降解 。葡萄糖引起的苯胺降解 速率的下降应是菌株 AN4 优先利用葡萄糖的结果 , 而硫酸铵对苯胺降解的抑制作用可能是因为在苯胺 降解为邻苯二酚的过程中产生 N H4+ , 而硫酸铵中 存在的 N H4+ 抑制了这一过程 。
AN117 能够代谢 22氯苯胺和 32氯苯胺 ,但是葡萄糖
图6  第二碳源和氮源对菌株 AN4 降解苯胺的影响 Fig. 6  Effect of t he secondary carbon so urce and nit rogen so urce o n AN4 degradatio n of aniline

降解苯胺的影响 ,结果见图 4 。由图 4 可见 ,降解苯 胺的最适温度为 30 ℃、 H 为 7. 0 。 p
2. 4. 2   苯胺初始浓度

   测定菌株 AN4 在苯胺初始质量浓度分别为
500 、 000 、 000 mg/ L 时的降解能力 ,结果见图 5 。 1 2

菌株 AN4 在苯胺初始质量浓度分别为 500 、 000 1
mg/ L 时 ,分别需要 24 、 h 降解完全 ; 而在苯胺初 40

始质量浓度为 2 000 mg/ L 时 ,经过 44 h 的降解 ,苯 胺质量浓度为 1 750 mg/ L 左右 ,降解效果不理想 。
2. 4. 3   第二碳源和氮源

   分别以 0. 2 % ( 质量分数 , 下同 ) 葡萄糖 、 2 % 0. 硫酸铵作为第二碳源和氮源时 ,菌株 AN4 对苯胺的 降解受到一定的抑制 , 但是 0. 2 %蛋白胨的存在却 对菌株 AN4 降解苯胺具有一定的促进作用 ( 见图
6 ) 。 HUN G等[ 6 ]215 曾报道葡萄糖对菌株 P Y99 在 KA

?14 ?

张逸飞等   一株苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性 表2  菌株 AN4 对抗生素耐受性1) Table 2  The antibiotic endurance of AN4
抗生素 质量浓度/ ( mg ? - 1 ) L 菌株 AN4 生长情况
1)

氨苄青酶素
100 -

金霉素
50 + +

红霉素
50 +

卡那霉素
80 + +

庆大霉素
50 +

青霉素
50 -

   : “ - ” 注 为不生长 “ + 、 + ” , + 分别为生长 、 生长较好 ,表 3 同 。

2. 5   菌株对苯胺的耐受能力和对抗生素 、 重金属的

适温度为 30 ℃、 H 为 7. 0 。在苯胺初始质量浓度 p 为 500 、 000 mg/ L 时 , 菌株 AN4 均可以很好地降 1 解苯胺 ,分别经过 24 、 h 降解完全 。菌株 AN4 还 32 可以多种芳香烃类化合物作为唯一碳源生长 。   ( 3) 菌株 AN4 对金霉素 、 卡那霉素具有较好的 抗性 ,对氨苄青霉素 、 青霉素无抗性 。所试浓度的重 金属对菌株 AN4 的生长均具有抑制作用 , 其中以
Hg2 + 和 Ag + 最为明显 。 ( 4 ) 代 谢 机 制 证 实 , 菌 株 AN4 在 邻 苯 二

敏感性    菌株 AN4 可在苯胺质量浓度为 3 000 mg/ L 的 L A 上生长 。菌株 AN4 对金霉素 、 卡那霉素具有较 好的抗性 , 对氨苄青霉素 、 青霉素无抗性 ( 见表 2 ) 。 所试浓度的重金属对菌株 AN4 的生长均具有一定的 抑制作用 ,其中以 Hg2 + 和 Ag + 最为明显 (见表 3) 。
表3  菌株 AN4 的重金属耐受性 Table 3  The heavy metal endurance of AN4
化合物 质量浓度 / ( mg ? - 1 ) L 菌株 AN4 生长情况 硫酸汞
0. 01 -

硫酸银
0. 025 -

硫酸铜
1 +

硫酸镍
1 +

氯化锰
1 +

双加氧酶种类的确定    由图 7 可见 ,260 nm 处菌株 AN4 降解邻苯二酚 的代谢产物均为粘糠酸 ,不含 22羟基粘糠酸半醛 ,说 明菌株 AN4 是通过邻苯二酚 1 ,22双加氧酶进行邻位 开环 ,通过邻位裂解途径降解邻苯二酚及其他芳香族 化合物 ,而不是通过间位裂解途径降解邻苯二酚及其
2. 6

他芳香族化合物 。大多数降解苯胺的菌株中均被证 实了经邻苯二酚途径的降解历程 ,其中大部分是通过 邻位降解[ 19 ] ,只有粪产碱杆菌 、 恶臭假单胞菌、 食酸 [ 20222 ] 丛毛单胞菌是通过间位降解 。
图7  邻苯二酚培养菌株 AN4 的液相色谱分析
( 邻苯二酚初始质量浓度为 500 mg/ L)

Fig. 7  H PL C diagram fo r t he catechol solution after growing AN4 (initial catechol co ncent ration = 500 mg/ L)

3  结



( 1) 分 离 出 一 株 高 效 苯 胺 降 解 菌 —— 株 —菌

AN4 。经 鉴 定 , 菌 株 AN4 为 金 黄 杆 菌 属 ( Ch r yseobacteri um s p . ) 。 ( 2) 菌株 AN4 利用苯胺生长和降解苯胺的最

酚 1 ,22双加氧酶作用下经邻位裂解途径降解苯胺 。 参考文献
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( 下转第 36 页)

?15 ?

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图 7   去除动力学拟合线 TP Fig. 7   Measured and simulated ce / co vs. HR T for TP removal in t he four wetland systems

3    结 论

  ( 1) 各种植物床对模拟生活污水 TN 、 的去 TP 除率随 H R T 的延长而增加 。不同植物床的脱氮除 磷效果是不同的 。风车草 、 、 茭白 薏苡和美人蕉植物 床均有较好的脱氮除磷效果 , 美人蕉植物床对 TN 的去除效果最好 , 茭白植物床对 TP 的去除效果最 好 。4 种植物床对氮磷的降解能力不低于目前已在 一些人工湿地中应用的植物床 , 可达到净化污水和 美化环境的双重功能 。   ( 2 ) 各种植物床出水 TN 、 浓度较低 。当 TP H R T 为 2 d 时 ,各种植物床处理后出水 TN 均低于
GB 18918 — 2002 一级标准 A 标准 。当 H R T 为 5 d

( 上接第 15 页)

[ 16 ]   TRACHAN P D , FREER A A , F EWSON C A. Purification S
coccus and cloning and sequencing of it s gene [ J ] . Biochem. ,

时 ,茭白 、 美人蕉植物床处理后出水 TP 低于一级标 准 B 标准 ,风车草 、 薏苡植物床处理后出水 TP 低于 二级标准 。   ( 3) 风车草 、 、 茭白 薏苡和美人蕉植物床对 TN 、
TP 的去除满足一级反应动力学方程 , TN 降解常数
k 分别为 0. 20 、 22 、 16 、 19 d 0. 0. 0.
- 1

[ 17 ]   曾国驱 ,任随周 ,许玫英 ,等 . 微生物降解苯胺的研究现状 [J ] .

; TP 降解常数 k

分别为 0. 22 、 45 、 18 、 30 d 0. 0. 0.

- 1

。各组一级反应动

力学方程相关性显著 ,可为实际工程设计提供参考 。 参考文献
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责任编辑 : 陈泽军  ( 修改稿收到日期 :2007211209) 责任编辑 : 黄 苇  ( 修改稿收到日期 :2007211205)


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