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中国药科大学













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RPE65 蛋白质的结构预测 Structure Prediction of the RPE65 Protein

指导教师 (院士) 课 题 完成场所
中国药科大学江宁校

论文工作时间: 年

月 至

年 月

RPE65 蛋白质的结构预测
目录

摘要 ??????????????????????????????1 前言 ??????????????????????????????2 第一章 背景介绍?????????????????????????3 生物信息学在蛋白质结构预测中的应用 ???????????????3 第二章 RPE65基因蛋白概述 ????????????????????6 2.1 RPE65基因蛋白的功能?????????????????????6 2.2 RPE65 蛋白质基因的组成???????????????????6 第三章 RPE65的3D结构模型预测 ??????????????????9 3.1 3D-PSSM获得RPE65的初步模型信息 ???????????????9 3.2 SCWRL软件预测侧链坐标 ???????????????????10 3.3 Jackal软件包对模型的修饰??????????????????12 第四章 结果和讨论 ???????????????????????14 第五章 视网膜色素变性研究进展 ?????????????????18 参考文献????????????????????????????20 致谢??????????????????????????????21

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RPE65 蛋白质的结构预测

摘要:应用生物信息学的方法对蛋白质结构的预测,为进一步研究蛋白质的生物学 功能开辟了一个新的领域。本课题的提出是通过生物信息学软件预测 RPE65 蛋白质 的三级结构,并根据获得的三维结构模型,对其蛋白质功能的可能机制进行讨论, 进而为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据。 关键词:蛋白质结构预测,视网膜,RPE65

Structure Prediction of the RPE65 Protein
Abstract:Using bioinformatics methods for protein structure prediction opens a new area for further study of protein biological function. The topic proposed by bioinformatics method to predict the natural conformation of RPE65 and its structures, according to obtained three-dimensional structure model of the protein to discuss its function and possible mechanisms. This method also provides a reliable basis for designing new proteins and modified proteins.

Keywords:protein structure prediction; retina; RPE65

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前言

视紫红质是感光细胞中的一种视色素,在光线的接收和视觉电位的产生方面具有重要 的生理作用,由视紫红质介导的过度光信号传导是光性视网膜变性的主要原因。近年的研 究表明,视网膜色素上皮细胞中的RPE65蛋白作为影响视紫红质再生的关键因素,与视网膜 光损伤的易感性密切相关[1]。 随着近年来生物信息学的快速发展,我们在该课题中应用生物信息学的研究方法对 RPE65 蛋白质的结构进行预测。 生物信息学的一项重要研究是从蛋白质的氨基酸序列预测蛋白质结构。它的重 点研究问题包括:有效建立“低同源性蛋白质比对方法”,为大部分蛋白质天然构 象能够得到准确预测提供有效的基础方法;在从头预测方法中,建立较为准确的力 场和有效的构象搜索算法,达到准确快速预测目的;建立准确有效地判断蛋白质天 然构象预测模型质量的方法。 可见通过生物信息学的方法对蛋白质结构的预测,为进一步研究蛋白质的生物 学功能开辟了一个新的领域。所谓的蛋白质结构预测就是如何从蛋白质的氨基酸序 列预测出其空间结构。由于蛋白质的生物学功能在很大程度上依赖于其空间结构 , 因此进行蛋白质的结构预测对了解未知蛋白生物学功能具有重要意义。 本课题即是通过计算机在 Linux 系统下获得 RPE65 蛋白质基因的三维立体结构 模型,进而讨论它在视觉周期中所发挥的重要作用。 课题所介绍的计算机模型的研究, 其主要过程是通过 3D-PSSM 服务器获取 RPE65 基因蛋白的初步三维结构模型, 其相应的侧链是从 SCWRL 中获得。 最后, 应用 Jackal 与 Charmm 力场对初步模型进行修复和完善。根据获得的三维结构模型,对蛋白质功 能的可能机制进行讨论。并了解该蛋白质的生物学功能,进而为设计新的蛋白质或 改造已有蛋白质提供可靠的依据, 同时为新的药物分子设计提供合理的靶分子结构 。

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第一章 背景介绍
生物信息学在蛋白质结构预测中的应用
目前,生物信息学主要是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析, 并从中归纳总结出生物系统的规律,是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之 一,同时也是 21 世纪自然科学的核心领域之一。其研究包括了基因组学、蛋白质组 学、系统生物学、比较基因组学,重点主要体现在基因组学(Genomics)和蛋白质组 学(Proteomics)两方面,具体说就是从核酸和蛋白质序列出发,分析序列中表达的 结构功能的生物信息。 1989 年在美国举办生物化学系统论与生物数学的计算机模 自 型国际会议,生物信息学已经发展到了计算生物学、计算系统生物学的时代。 生物信息学的目标包括:1)组织由实验中获取的大量有关生物学的数据即建立相应 的数据库,如 PDB,Genbank,SwissProt 等;2)方法学的研究——建立分析这些数据的 方法,如 FASTA,PSI-BLAST,基因的确定,蛋白质结构预测等;3)应用这些方法分析 相关的数据,提取对生物学工作者尤其是实验工作者关心的生物学信息。 生物信息学的重要研究课题有:大规模基因组测序中的信息分析;新基因和新 SNP 的发现与鉴定;非编码区信息结构分析;遗传密码的起源和生物进化;完整基因组的比较 研究;大规模基因功能表达谱的分析;生物大分子的结构模拟与药物设计;生物信息学 分析方法的研究;建立国家生物医学数据库与服务系统等[2]。 其中的生物大分子结构模拟与药物设计与我们的药学事业联系紧密, 它改变了现代药 学研究的模式,为 21 世纪药学专业的发展提供了强大的动力。随着人类基因组计划和相 关测序技术的发展, 如今人们已经获得了大量蛋白质的一级序列。 然而要了解这些蛋白质 功能的分子基础,只有氨基酸序列知识是不够的,必须要知道他们的三维结构(即空间构 象)。与此同时,要设计药物也需要了解与药物相应的蛋白质受体的三维结构。这是摆 在科学家面前的紧迫任务。当前,虽然 X 射线晶体学技术、NMR、二维电子衍射等为蛋 白质空间结构测定提供了有效的实验手段, 但是这些方法提供蛋白质三维结构的速度还远 小于蛋白质序列信息的增长速度。此外,这些方法还存在多种局限。此时,理论模拟与结 构预测就显示了重要性[2]。 蛋白质结构预测问题就是如何从蛋白质的氨基酸序列出发预测它的功能构象问题。 对蛋白质结构预测进行研究对基础理论和实际应用都有重大意义。在理论上,如果弄清

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楚蛋白质一级结构是如何决定其高级结构这个基本问题, 将会使人们更系统和完整地理解 生物信息从DNA 到具有生物活性蛋白质的传递全过程,使中心法则得到更完整的阐明, 从而对生命过程中的各现象有进一步的深刻认识,最终推动生命科学的快速发展。 具体的讲,蛋白质结构预测的理论预测方法可分为三大类 (1)同源建模法 同源建模法(比较建模法)是基于知识的蛋白质结构预测方法。这一方法目前主要是 指同源结构预测。 它是在未知蛋白质中有同源结构可以参考的情况下应用的一种技术。 它 可以根据同源结构中保守的部分搭建出未知蛋白质的结构骨架。它是现在最为成熟的预 测方法。蛋白质根据序列同源性可以分成不同的家族。一般认为序列同源性大于30%的 蛋白质可能由同一祖先进化而来,称为同源蛋白质。同源蛋白质具有相似的结构和功能。 所以利用结构已知的同源蛋白质可以建立目标蛋白质的结构模型, 然后用理论计算方法进 行优化。 利用同源模建方法建立的蛋白质模型是以已知的同源蛋白质结构为基础的, 所以 这是一种基于现代生物学知识的预测方法。同源模建的基本过程包括六部分:目标序列 与模板序列的匹配; 根据同源蛋白质的多重序列匹配结果, 确定同源蛋白质的结构保守区 以及相应的框架结构; 目标蛋白质结构保守区的主链模建; 目标蛋白质结构变异区的主链 模建;侧链的安装和优化;对模建结构进行优化和评估。序列匹配对建立精确的结构模型 起着关键作用。 一般地, 序列同源性越差, 匹配的准确程度越低, 建立的模型精度也越差; 序列同源性低于30%的蛋白质难以得到理想的结构模型。传统的序列分30%的蛋白质难以 得到理想的结构模型。 (2)折叠识别法 它可以应用到没有同源结构的情况中, 且不需要预测二级结构, 即可直接预测三维结 构,从而可以绕过现阶段二级结构预测准确性不超过65%的限度,因此是一种有潜力的预 测方法。它的主要原理是把未知蛋白质的序列和已知的这种结构进行匹配,找出一种或 几种匹配最好的结构作为未知蛋白质的预测结构。 它的实现过程是总结出已知的独立的蛋 白质结构模式作为未知结构进行匹配的模板, 然后经过对现有的数据库的学习, 总结出可 以区分正误结构的平均势函数作为判别标准, 来选择出最佳的匹配方式。 它的局限性是假 定的蛋白质折叠类型是有限的。所以只有未知蛋白质和已知蛋白质结构相像的时候,才 有可能预测出未知的蛋白质结构。
[3,4]



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(3)从头预测法 它要求方法本身可以指根据蛋白质的氨基酸序列来预测蛋白质的二级结构和高级结 构,从理论上讲是最为理想的方法。但现在所有的方法还不能完全达到这个要求。从头预 测法又可细分为,二级结构预测、超二级结构预测、蛋白质结构类型预测、蛋白质折叠模 式预测、 详细的三维结构的直接预测等。 从蛋白质序列预测空间结构是蛋白质结构预测的 最终目标。然而这种方法一直受到两方面的困扰:首先,难以找到一个能严格区分蛋白质 的天然构象和非天然构象的能量函数, 使能量函数的全局极小点对应蛋白质天然结构。 目 前已有的能量函数都采用经验势函数;其次,由于蛋白质系统分子量和柔性都很大,所以 在蛋白质的势能面上存在着极多的局部极小点, 缺少一种有效的全局优化算法也制约着这 种方法的发展。 在利用分子力场建立能量函数的过程中, 模型的准确性和模型的简化是需 要权衡的基本矛盾. 然而, 蛋白质的三维结构预测是蛋白质结构预测的最终目标。 目前还没有一种预测方 法能得到比较满意的结果。 蛋白质的三维结构预测是根据二级结构预测的结果以及蛋白质 结构类型和折叠类型预测的结果,考虑到结构间的立体化学性质,亲疏水性质,氢键以及 静电相互作用,把可信度较高的二级结构进一步组装,搭建出最后的蛋白质空间结构。这 种方法虽可构建出一些蛋白质结构, 不过因为它依赖于前面的预测结果, 所以受到的限制 太多。另一个方向是不依赖二级结构预测的结果,直接预测三维结构的方法。在这个方向 中最原始的方法是借用成功的应用小分子构象研究的分子动力学和分子热力学方法。 对蛋 白质整个构象空间进行搜索, 然后找出能量最低的构象作为最后的预测构象。 由于这种方 法的计算量非常大, 所以这种方法已经不再应用到蛋白质结构的从头预测问题。 这种方法 的基本框架被继承下来。 由于上述两种方法的局限性, 无法单独完成预测工作, 因而将其合并用来预测目标基 因蛋白。在本课题的研究中,通过对基因蛋白的氨基酸序列的搜索,建立初步结构模型, 再对其进行侧链的预测,获得完整的结构信息,最后利用分子力学完善初步结构,并取得 最后的模型。

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第二章 RPE65基因蛋白概述

2.1 RPE65基因蛋白的功能
视网膜之所以能感受光线是由于其含有高度分化的感光细胞-视锥和视杆细胞,而关 于视觉形成的化学机制研究源于在蛙眼感光细胞中发现了一种能够感光的色素-感光色素, 它是视网膜把光线刺激转化为神经冲动从而形成视觉冲动的物质基础。 视细胞中的感光色 素主要就是视紫红质( rhodop sin,RHO) [1]。 RPE65[retinal pigment epithelial(cells) 65 kDa protein]是视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelial,RPE)细胞内一个65kDa的蛋白质,是维生素A循环 (retinoid cycle,RC),又称视循环(visual cycle,VC)中的异构酶。RPE位于视网 膜最外层,具有吞噬感光细胞脱落盘膜、参与维生素A 在视网膜中的代谢、构成血-视网膜 屏障等重要的生理功能。REP65基因定位于1p31,该基因仅在RPE细胞中特异表达的蛋白 RPE65。 RPE65基因的功能是结合全反式视黄酯,并提供给isomerohydrolase(IMH), IMH可以异构化和水解11-顺式视黄醇。RPE65基因不仅可以结合全反式视黄酯,而且 可以从细胞膜中提取酯,虽然它没有内在的催化能力,但也可以影响IMH的活动。 1998年Redmond等发现RPE65是11-顺-视黄醇生成过程中所必需的蛋白质, 是催化全反 视黄醇( all-trans retinol) 转变成11-顺视黄醇( 11-cis retinol)的异构酶之一, 11-顺视黄醇再 经过一系列代谢转变成视紫红质,继而参与光信号的传导过程 。研究发现在某些啮齿动 物模型中,视网膜光损伤的易感性( light damage suscep tibility, LDS) 是由其基因决定的,而 RPE65在其中扮演了重要的角色
[6,7] [5]

。2005年Redmond等证实RPE65即为视黄醇异构酶。但

是由于RPE65的的孤立状态以及结晶困难,迄今为止它的具体结构和作用机制仍不明确。

2.2 RPE65 蛋白质基因的组成
RPE65 基因蛋白包含两种构型:sRPE65 和 mRPE65。sRPE65 存在于细胞质中,具 有可溶性,而 mRPE65 和细胞膜相关。两者在棕榈酰化的过程中,结构会发生变化: mRPE65 有三个残基被棕榈酰化,并且是全反式视黄酯的分子伴侣,它结合视黄 酯后,提供给 IMH,进入视觉周期并将其转化成视黄醛,但它本身没有催化能力。

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sRPE65 具有低亲酯性,不能棕榈酰化,作为全反式视黄醇(维生素 A)的分子 伴侣,而不能和视黄酯相结合。 因此,可以通过RPE65的棕榈酰化作用来选择性控制与何种配体的结合。而这 两种蛋白通过卵磷脂视黄醇酰化转移酶(LRAT)可相互转化,从而使它们扮演分子 开关的作用,如图(Fig.1) 。
[8]

Fig. 1. The Mammalian Visual Cycle

这里所提到的棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质共价修饰的一种重要形式, 对象主要是胞 质蛋白质,棕榈酰化对蛋白质功能产生多重影响。 棕榈酰基是十六碳脂肪酰基。 膜蛋白的棕榈酰化修饰非常普遍, 它是在肽链合成完毕 之后发生的。棕榈酰基的供体是棕榈酰辅酶A,受体是蛋白质分子中Cys残基。在酶的催化 下,棕榈酰基通过一个硫酸酯键与底物蛋白质分子上的Cys残基共价结合,并通过疏水的 酯酰基将蛋白质定位于质膜。例如视紫红质是I型跨膜蛋白,C端直胞质内,可通过两个S棕榈酰基与膜结合。 被修饰的Cys残基可以位于底物蛋白的N端附近 (如鸟苷酸结合蛋白的
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G亚基) C端附近 , (如5-羟色胺受体) 获跨膜结构附近 (如抗利尿素受体) 如图 , (Fig.2)
[9]

。但在被修饰的Cys残基附近未发现有保守序列。蛋白质的棕榈酰化修饰过程是可逆的。

被棕榈酰化修饰的蛋白质大多数定位于膜上的整合蛋白, 其中相当多为受体蛋白, 它也能 调节蛋白质与膜,以及蛋白质与蛋白质的动态相互作用
[10]



Fig. 2. The role of the palmitic acid molecules in the mRPE65 model.

综上, 我们可以根据其相同的氨基酸序列和棕榈链的构象效应预测他们相似的结构和 功能。在这项工作中,应用计算机方法预测mRPE65和sRPE65的蛋白质结构。由于 mRPE65蛋白质结构和sRPE65几乎相同,因而当我们在描述蛋白质结构预测的是,使用 RPE65基因蛋白表示他们两个。

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第三章 RPE65的3D结构模型预测

在本课题的研究中,同源建模法和分子力学方法已被合并用来预测RPE65基因蛋白。 由于上述两个方法无法单独的完成预测工作,因而将这种方法作为首选。 在背景介绍中所提到的,同源建模法有其局限性,因为RPE65基因蛋白在已知的蛋白 质结构数据库中很少有同源实体。而分子力学的结构预测的不准确性在于其高的CPU利用 率以及在处理RPE65基因等高分子量蛋白存在困难。 我们的做法是,先利用3D-PSSM 网络服务器获得了RPE65蛋白的初级模型,然后用 SCWRL计算其侧链坐标,再使用一种基于CHARMM力场的预测软件(Jackal软件包)对初级 模型进行确定和修饰,最后根据所预测的三级结构模型推断出了该蛋白的功能
[11]



3.1 3D-PSSM获得RPE65的初步模型信息
课题的预测始于在数据库中RPE65基因蛋白氨基酸序列的搜索。 人类RPE65基因序列由533个残基组成(Table 1),由SWISSPROT数据库通过SDSC http://workbench.sdsc.edu.获得。 将已知的氨基酸序列通过在线服务器3D-PSSM,进行注册,提交,输出的结果会发送 至注册的邮箱中,获得RPE65的初步结构模型信息文件RPE65_In.pdb。 这里所提到的3D-PSSM服务器是在线的结构模型预测软件。 3D-PSSM可以检测到类似 的同源蛋白质结构模型, 特别是通过在活性位点的比较, 即使它们之间的氨基酸序列相似 性较低,也可以得到比较接近的模型。3D-PSSM不仅包含该蛋白质的氨基酸序列信息,而 且还有他们的结构信息, 比如二级结构和溶剂化潜力。 它可以代表蛋白质胜过简单的氨基 酸序列。由于在已知的结构数据库中没有相近的同源蛋白质,因而这些信息在预测RPE65 的结构中尤其有用
[12]



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Table 1 Amino acid sequence of human RPE65 MSIQVEHPAGGYKKLFETVEELSSPLTAHVTGRIPLWLT GSLLRCGPGLFEVGSEPFYHLFDGQALLHKFDFKEGHVTY HRRFIRTDAYVRAMTEKRIVITEFGTCAFPDPCKNIF SRFFSYFRGVEVTDNALVNVYPVGEDYYACTETNFI TKINPETLETIKQVDLCNYVSVNGATAHPHIENDGT VYNIGNCFGKNFSIAYNIVKIPPLQADKEDPISKSEIVV QFPCSDRFKPSYVHSFGLTPNYIVFVETPVKINLFKFLSSW SLWGANYMDCFESNETMGVWLHIADKKRKKYLNNK YRTSPFNLFHHINTYEDNGFLIVDLCCWKGFEFVYN YLYLANLRENWEEVKKNARKAPQPEVRRYVLPLNID KADTGKNLVTLPNTTATAILCSDETIWLEPEVLFSGP RQAFEFPQINYQKYCGKPYTYAYGLGLNHFVPDRLCKLN VKTKETWVWQEPDSYPSEPIFVSHPDALEEDDGVVLSVV VSPGAGQKPAYLLILNAKDLSEVARAEVEINIPVTFHGLFKK

3.2 SCWRL软件预测侧链坐标
由3D-PSSM获得RPE65蛋白的主链信息后,则通过SCWRL软件预测其侧链坐标。 SCWRL软件由Dunbrack实验室研发, 是目前国际上使用最广泛的蛋白质侧链预测软件, 以计算速度快著称。它的出现为未知蛋白质结构和功能的预测提供了强大的技术支持。 其运行的主要步骤为: 1)将主链骨架依赖型转子库中出现概率最高的转子安插在主链上; 2)分别考虑主链与侧链和侧链与侧链之间的位阻,其算法为图表分解法,因该算法 是将连续的肽链变成分散的二联通结构进行计算,故有效地简化了计算过程; 3)修饰侧链
[13]



3.1.1 SCWRL软件的安装
SCWRL可免费下载,Windows和Linux系统下都有兼容版本。可在以下网址下载 http://dunbrack.fccc.edu/scwrl4 。下载时需要进行注册,作者会把下载地址发到 注 册 者 的 邮 箱 里 。 我 们 现 介 绍 Linux 系 统 下 该 软 件 的 安 装 及 使 用 : 把 下 载 好 的 scwrl4_lin.tar.gz 解压缩,会产生如下 4 个文件 BBDep.bin 、setup、scwrl4_ 、 README.scwrl4,其中 BBDep.bin 是主链依赖型旋转异构体库,README.scwrl4 中是该软
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件的英文使用说明。在解压后所存放的文件目录下输入命令./ install,即可完成安装。 以后产生的输出文件也将放在这个文件目录下。

3.1.2 SCWRL 软件的使用
本课题所需侧链信息只需输入命令: Scwrl4 ?i RPE65_In.pdb –o RPE65_Out.pdb > logfile 其意义为: -i(必选) 必须有主链,可以没有侧链、辅因子或者溶剂信息,而且必须为 PDB 格式。主链中如 不完整或者残基名字与 20 中标准氨基酸名字不符的,该位置残基则以甘氨酸处理。程序 会从第一个残基开始读取。如果使用者想改变序列内容,可参照下面的-s 项操作。 -o(必选) 输出文件仍为 PDB 格式。 内容包括了与输入的文件相同主链坐标以及所预测的侧链信 息。 > log 产生一个名为 log 文件,里面包括了对该结构进行图论分析的结果或者预测过程中 出现的一些问题的说明。 通过 SCWRL 计算出的侧链坐标的模型显示如 Fig. 3.

Fig. 3. Preliminary structural model of RPE65 obtained from the 3DPSSM server and the 11

中国药科大学本科生毕业论文(设计) program SCWRL. The structural elements are color coded as yellow is b-strand, white is random coil and cyan is a turn.

3.3 Jackal软件包对模型的修饰
在 RPE65 的原始模型中,存在 1.23910E18kcal/mol 非常巨大的势能,这意味着模型 处于不稳定,并且原子相互之间存在不利的接触,所以我们采用 Jackal 软件包来进一步 完善这个模型,实现能量最小化。

3.3.1 Jackal 软件的安装
Jackal 是一个蛋白质结构建模软件,由约 90,000 行 C + +代码作为核心部分组成。 它应用于修复丢失的残基并在基因蛋白的原始模型中添加氢原子。 可以通过登录网址 http://trantor.bioc.columbia.edu/programs/jackal 下载该软
件。

将下载好的 jackal_linux.tar.gz 软件包解压缩后,得到以下 11 个文件: 1)nest : 在提供氨基酸序列模板基础上建模 2)loopy:蛋白质循环预测 3)scap:蛋白质侧链预测 4)profix:蛋白质失踪原子和残基预测 5)ctrip:CA 原子的蛋白质骨架预测 6)conref:蛋白质结构完善 7)minst:蛋白质结构能量最小化的精加工 8)addh:氢原子的重建 9)surface:溶剂表面积计算 10)nalgn:两个蛋白质的叠加 11)rotate:蛋白质的空间扭转角度

3.3.2 Jackal 软件的使用
在本课题所研究的过程中, 为了使模型达到能量最小化, 我们通过 minst 这个工具来 完成。Minst 是一个能量最小化方案,在 CHARMM22 立场中通过三个层次减少蛋白质结构 的能量: 1)消除原子间发生的冲突;

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2)所有环状区域能量最小化; 3)规则的二级结构区域以及环状区域能量最小化。 在所存放的文件目录下输入命令./ minst 即可进行该工具的安装和使用。产生的输出 文件也将放在这个文件目录下。输入如下命令: Minst –prm 1 –opt 3 RPE65_Out.pdb 其意义如下: -prm 1 CHARMM22 立场使所有原子能量最小化 -opt 3 细化所有环状区域以及二级结构区域 运行后输出的文件 RPE65_Out_final.pdb 在相应的目录下。 比较蛋白质结构模型在一个周期, 二十周期, 五十周期后发现, 在能量最小化过程中, 当蛋白质势能减少,其β -sheets 会缩短。从蛋白质势能绘制的最小周期数图形(Fig.4) 中可以看出大部分不利触点在第 8 周期后被淘汰,因此,在第 10 周期后的结构用于随后 进行的计算
[12]



Fig.4. Potential energy of RPE65 model vs. the number of minimization cycles obtained from Jackal.

进一步的最小化将导致在这个能源程序中β -sheets 的结合位点更短。 这一步的获得 如图(Fig.5) ,在这种模式下,β -sheets 的减少主要发生在其结构的上部,在较低的结 合 位 点 的 部 分 不 受 影 响 。 程 序 运 行 后 的 势 能 从 1.23910E18kcal/mol 减 少 至
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-5147.67kcal/mol. β -sheets 在这个模型中也减少了长度。

Fig. 5. Model of RPE65 obtained from Jackal after cycle 10.

第四章 结果和讨论

通过Jackal软件包的修饰后,我们得到了最终的模型(Fig.7)。以此模型为例,详 细的讨论RPE65的基因蛋白的三级结构。 三维RPE65基因蛋白结构模型有一个变体和右手扭曲反平行的β -barrel。这种β -barrel可形成蛋白质核心的疏水环境, 它与文献报告中的β -barrel是一致的, 无论平行 或者反平行, 都必须右手扭曲。 这个β -barrel与REP65基因在蛋白视觉周期中发挥生物作 用密切相关。 而三维结构的细菌视紫红质做为一个跨膜蛋白已经被广泛用于解释视觉周期 的很多方面,并且建立了其光驱动质子泵功能的机制。 在视觉周期中, RPE65基因蛋白的作用是结合全反式视黄酯并将其传输到IMH, 但全 反式视黄酯是疏水性的,因而与RPE65成键就需要一个疏水环境使它们保持稳定。右手 扭曲反平行的β -barrel,一面具有亲水性,另一面具有疏水性。这个内部疏水,外部亲 水的性质,使蛋白质在细胞质中可以溶剂化。β -barrel的两亲的性质,为全反式视黄酯 的结合提供所需的环境。
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反平行的β -barrel的变体结构也是RPE65基因功能所必须的。在被RPE65运输之前, 全反式视黄酯位于滑面内质网,需要一种方式,进入RPE65基因蛋白的核心。裂解的RPE65 基因结构显示如图(Fig.6)
[12]



Fig. 6. Cleft in the model of RPE65. The structural elements are color coded as yellow is b strand, white is random coil and cyan is a turn.

我们得到最终模型(Fig.7)后进行讨论, 进而推断有关目前的RPE65基因蛋白质结构的 实验结果。 从模型中可以看出, mRPE65的棕榈酰化点Cys231, Cys329和Cys330位于RPE65 蛋白图像左侧β 链的环状部分, 这些残基都接近开放裂。 这一立场使它们能够帮助酯进入 蛋白质的核心。

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Fig. 7. Positions of possible binding residues in the model of RPE65.

在mRPE65的模型(Fig.8)中有三个区域,并且每个区域由右手扭曲反平行β 桶装结 构组成,在这些内部疏水的β 桶装结构,有利于结合疏水的全反式视黄酯。半胱氨酸残基 Cys231, Cys329和Cys330和它们长的碳链延伸到蛋白质的内部, 而这些长的碳链有很高的 亲酯性,可以提供一个适合的疏水环境,因此我们预测它们位于细胞膜的疏水区域,并且 用于在细胞膜表面固定mRPE65。 而sREP65不能结合任何棕榈酰酸, 所以它的亲水表面不能 固定在细胞膜表面。 这也可以解释为什么mRPE65是膜相关的, 而sRPE65细胞溶质的。 因此, 我们推断,全反式视黄酯进入mRPE65蛋白是在棕榈链的帮助下进行的 。
[9]

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Fig. 8. The mRPE65 protein and the all-trans retinyl ester model (not to scale for clarity).

在模型(Fig.7)中, Tyr368位于靠近中间环的位置, Leu450位于RPE65蛋白β 链的右侧, 它们都接近蛋白质的疏水中心, 它们的突变会导致蛋白质功能的障碍, 因而在结合全反式 视黄酯的过程中发挥了重要的作用。根据能量对接的结果(Table 2)当全反式视黄酯在 Leu附近进行对接时,能量低于它在β 链二区域中心的势能,而它的突变将引起对接势能 的增加,这些结果表明,Leu450很接近于全反式视黄酯的结合位点,它可能是结合位点固 有的部分
[12]



Table 2 Docking energy results of all-trans retinyl ester near LEU450 and TYR36 . Docking energy (kcal/mol) LEU450 63.12 Domain two 105.35 TYR368 316.06 LEU450MET 90.72 TYR368HIS 209.72 TYR368HIS* 76.39 TYR368HIS*: the docking energy of the ester near LEU450 with TYR368HIS mutation

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当全反式视黄酯在Tyr368附近对接时, 它的势能明显高于在β 链的第二区域中心的势 能, 结果表明它比β 链二区域离全反式视黄酯结合位点更远, 但当全反式视黄酯在Leu450 附近对接时, Tyr368His的突变依然能导致势能的增加, 因而推测Tyr的突变能够影响全反 式视黄酯的结合位点。 综上,我们提出一种mRPE65和全反式视黄酯之间相互作用的可能机制。如下: 当全反式视黄酯进入蛋白质的核心,通过三个棕榈链分别位于Cys231,Cys329和Cys330 的帮助下进行, 同时, 在反平行β 桶装结构和一些残基如Leu450的相互作用下使酯处于稳 定的疏水环境中。而Y368在全反式视黄酯转移过程中也起到了重要的作用。

第五章 视网膜色素变性研究进展

近年研究证实视紫红质和RPE65蛋白的异常是视网膜变性疾病发生的重要原因。视网 膜色素变性( retinitis p igmentosa, RP) 是因感光细胞和色素上皮细胞变性而导致进 行性视野缺损的一组常见遗传性致盲眼底病,通常具有常染色体显性、常染色体隐性和性 连锁遗传三种遗传方式,目前已发现多达150 个基因突变位点与RP 有关。 其中视紫红质基 因是最常见的引起常染色体显性RP的基因,约30 %的RP患者是由视紫红质基因突变引起的, 其突变时会产生有害的视蛋白,干扰正常的视功能; RPE65基因位点的突变则是常染色体 隐性RP一种常见的原因, RPE65突变可导致视网膜的视黄醛代谢循环过程紊乱, 导致视
[14]

网膜中视紫红质含量减低,相当与视网膜长时间处于暗环境中



此外, Leber先天性黑蒙(Leber congenital amauro2sis, LCA)也是一种与视紫红质 代谢相关的严重常染色体隐性遗传的视网膜营养障碍疾病,它约占到所有视网膜变性疾病 的5 % ,是导致婴幼儿先天性视盲的常见原因。近年发现了数种与LCA相关的致病基因, 其 中RPE65基因的突变占了LCA 病例中的10 % ~15 %
[15]



LCA的基因治疗策略是通过引入外源性基因, 产生具备正常功能的相关蛋白。 在RPE65 基因缺失的小鼠中可见全反式视黄酯积蓄、 视紫红质含量降低、 视杆细胞退化和光感受器 细胞结构紊乱,若给予外源性9-顺-视黄醇,可促进视紫红质的生成和ERG的改善。Acland 等将整合野生型RPE65基因的腺相关病毒注入RPE65狗的视网膜下腔,观察4个月后评价瞳 孔光反应和ERG,治疗组较对照组有明显改善,行为实验证明治疗组狗视力得以恢复,通
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过PCR证实了注射转基因腺相关病毒的视网膜象限中RPE、 脉络膜和视网膜神经上皮层中均 存在野生型RPE65的表达。 针对RPE65的基因治疗取得了鼓舞人心的效果, 但其长期有效性 和安全性有待进一步研究。 可以预见随着LCA相关基因研究的深入, 以RPE65为代表的基因 治疗将成为未来LCA治疗的主要方向,其极有可能成为在网膜变性疾病中首先应用于临床 的基因治疗方法。随着对Rpe65 蛋白研究的深入,相信会进一步阐明视网膜变性等多种视 网膜相关疾病的分子病理机制,并将为其治疗提供新的策略
[16]



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参考文献

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致谢

首先感谢院士的总体设计与指导,通过第一次组会的学习,总设计师对科学研究的执 著追求及高尚的学术道德是我整个实习期间的精神支柱。 本文的完成工作得到了方慧生老 师的大力帮助,在论文的定向、修改和审定过程中提供很多的指导,同时感谢生物信息学

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