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水母雪莲愈伤组织cDNA文库的构建


植物学通报  2004, 21 (1): 61 ̄65 Chinese Bulletin of Botany

水母雪莲愈伤组织 cDNA 文库的构建

1



② 金治平  1 赵德修     2 乔传令  1 付春祥

(中国科学院植物研究所

北京

100093)

2

(中国科学院动物研究所

北京

100090)

摘要

用 TRIZOL Reagent 提取水母雪莲红色系 1~15 d 愈伤组织总 RNA,用 SMART cDNA Library

Construction Kit 构建 cDNA 文库。经测定原始文库滴度达到 1.5~4 × 10 6,扩增总文库滴度达到 10 11, 重组率达到 98%,插入片段在 0.5 kb 到 3 kb 之间,多在 1 kb 左右。通过 PCR 检测,从总文库中检 测到了雪莲 CHS、DFR 及 SmP 基因的特异片段。SmP 基因是转录调控因子,其表达丰度很低。各项 指标都表明,已获得高质量的 cDNA 文库,为雪莲基因资源保存,雪莲类黄酮次生代谢分子调控奠 定了坚实的基础。 关键词 水母雪莲, 愈伤组织, cDNA 文库

Construction of cDNA Library from the Callus of Saussrea medusa Maxim
1

JIN Zhi-Ping
1 2

1

ZHAO De-Xiu②

2

QIAO Chuan-Ling

1

FU Chun-Xiang

(Institute of Botany, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093) (Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100090)

Abstract

Total RNA of 1~15 d red line callus of S.medusa was extracted by TRIZOL Reagent. cDNA

library was constructed with SMART cDNA Library Construction Kit. The primary library has a high titer from 1.5×106 to 4×106, in which 98% clones are recombinant and the insert cDNAs are from 0.5 kb to 3 kb. The amplified library has a titer of 1011. The positive signals of CHS, DFR and SmP gene were detected by PCR in the amplified library, though SmP gene was expressed at low abundance . This high quality cDNA library provides a useful tool for the study of the molecular mechanisms of the secondary metabolism of the flavonoids of S.medusa. Key words Saussrea medusa Maxim, Callus, cDNA library

水母雪莲(Saussrea medusa Maxim)是我国珍稀传统中药材, 其主要有效成分为类黄酮类次 生代谢产物, 其中高车前素 (hispidulin) 和金合欢素 (jaceosidin) 两种3-脱氧类黄酮具有抗腹 水型肝癌等多种功能 (韩书亮, 1995) 。类黄酮生物合成途径是目前研究得比较清楚的次生代 谢途径之一 Koes et al,1994) ( 。该途径的大多数关键酶基因都已被克隆, 尤其是能对多个关 键酶基因同时进行调控的转录调控因子C1、 P等基因也被克隆并已在玉米的类黄酮生物合成 R、
① 国家自然科学基金资助项目(No.39970896);中国科学院知识创新项目(No.KSCXI-09)。 ② 通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zhaodx@ns.ibcas.ac.cn 作者简介:金治平,中国科学院植物研究所 2 0 0 0 级博士生。赵德修,中国科学院植物研究所研究员,博 士生导师。长期从事植物次生代谢研究。 收稿日期:2002-12-29 接受日期:2003-07-07 责任编辑:孙冬花

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调控中取得成功 (Paz-Ares et al, 1987; Roth et al,1991; Grotewold et al, 1998) 为研究类黄酮 , 次生代谢的分子调控奠定了基础。本研究以水母雪莲红色系愈伤组织为材料, 构建cDNA文 库, 为保存雪莲基因资源, 分离克隆雪莲类黄酮生物合成途径中的关键酶基因如CHS (chalcone synthase)、 DFR (dihydroflavonol 4-reductase)等及调控该途径的R2R3-Myb转录调控因子SmP (S. medusa Myb-related P gene) 基因, 及开发雪莲有效成分与相关基础研究奠定基础。

1
1.1

材料与方法
材料 建库所用水母雪莲 (S. medusa) 1~15 d愈伤组织红色系为本实验室保存。文库构建试剂盒

SMART cDNA Library Construction Kit (Catlog# : K1051-1)购自CLOTECH公司, 包装蛋白Packagene Lambda DNA Packaging System 购自PROMEGA公司, RNA提取试剂TRIZOL Reagent购自GIBCO 公司, 其他常规试剂及耗材均为国产。 1.2 引物设计 检测文库插入片段大小的PCR引物根据文库载体λTripIEx2的MCS位点已知序列设计 : Pλ1 5'- AAG CGC GCC ATT GTG TTG - 3' Pλ2 5'- AAG TGA GCT CGA ATT GCG G - 3' 检测文库覆盖度的三对基因特异引物都是根据雪莲CHS、 DFR、 SmP基因的特异探针(本实 验室克隆, 将另文发表) 设计: PCHS1 5'- GGC ATT AAG GAA TGG GGC A - 3' PCHS2 5'- GCA ACC CTG CTG ATA CAT CAT - 3' PDFR1 5'- GAG AAT GAA GTG ATC AAA CC - 3' PDFR2 5'- AAA ATA CAT CCA TCC GGT CAT - 3' PSmP1 5'- CAT GTC GGT TGA GTT GGG TG - 3' PSmP2 5'- CGT TGT CAC TTC TTC CAG GCA - 3' 1.3 方法 取雪莲愈伤组织红色系1~15 d细胞, 每天50 mg, 混合共计750 mg, 加入 1.3.1 总RNA的提取

液氮迅速研磨后, 立即加入8 mL TRIZOL Reagent, 待解冻混匀后, 分装到8个DEPC处理的1.5 mL离心管中, 接下来的操作参照TRIZOL Reagent说明书进行。用75%乙醇洗涤后, 取一管 RNA用DEPC处理的水溶解, 分成三份, 第一份用于检测RNA的纯度及含量, 将第二份置于37 ℃下保育2 h后, 再与第三份做非变性琼脂糖电泳, 检测RNA的完整性和稳定性。 1.3.2 cDNA第一链的合成与LD-PCR (long distance PCR) 取2 ?L (约1.5 ?g) 总RNA, 参 照试剂盒操作程序做反转录及LD-PCR。取5 ?L LD-PCR产物, 1.1%TAE胶电泳检测。 1.3.3 cDNA的纯化与回收 参照试剂盒操作程序, 取50 ?L LD-PCR产物, 加入2 ?L蛋白酶K (20 ?g/?L) 于45℃保育20 min消化残存的Taq 酶。纯化回收cDNA, , 用Sfi Ⅰ于50℃酶切 2 h产生粘性末端。将酶切产物过CHROMA SPIN-400柱, 每管过柱收集物取3 ?L电泳检测, 回 收500 bp以上的cDNA片段。 1.3.4 cDNA与λTripIEx2的连接与包装 参照试剂盒要求分别取0.5 ?L、 ?L、 ?L cDNA 1.0 1.5 与1 ?LλTripIEx2载体设置三个试连接反应, 16℃下连接过夜, 22℃包装3 h, 每管中加225 ?L

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1×λdilution buffer与12.5 ?L氯仿, 混匀后高速离心分层, 获得原始文库。测定三个试连接滴 度后, 按最高滴度试连接的cDNA与载体比例, 放大连接和包装。 1.3.5 1.3.5.1 文库质量评价 原始文库与扩增文库滴度测定 取5 ?L原始文库做10倍梯度稀释, 测定原始文库滴

度 按 个 cm平板5×104 个独立克隆扩增原始文库。单独收集每个平板的裂解物, 。 每 12 加入少
许氯仿, 混匀后7500 r/min离心10 min, 取上清作为一个亚文库, 每个亚文库取1 mL混匀为总文 库。取5 ?L总文库做梯度稀释, 测定总文库滴度。每个亚文库及总文库各取1 mL保存于4℃ 随时备用, 其余的均加入7%DMSO, 保存于-70℃。 1.3.5.2 文库插入片段大小及重组率检测 从原始文库中随机挑选50个单噬菌斑与100 ?L 1× λdilution buffer中, 振荡洗脱, 于4℃冰箱中过夜。取3 ?L洗脱物为模板, λ1 和P λ2 为引 以P 物, 做PCR检测插入片段大小并估计文库重组率。扩增条件:在95℃变性10 min裂解噬菌体 后, 再加入PCR反应混合物, 并按以下程序扩增:94℃预变性4 min;94℃变性1 min, 56℃退 火1 min, 72℃延伸4 min, 25循环;72℃延伸10 min。 1.3.5.3 从扩增总文库中检测目的基因 三个特异基因检测都采用Touch down PCR, 并以各 自片段克隆质粒为阳性对照, 用相同的扩增条件:在95℃变性10 min裂解噬菌体, 加入PCR反 应混合物, 并按以下程序扩增:94℃变性4 min;94℃变性1 min, 65~50℃退火1 min, 每循环 退火温度下降0.5℃, 72℃延伸1 min, 30循环;94℃变性1 min, 50℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 循环;72℃延伸5 min。 15

2 实验结果
2.1 RNA的提取 在非变性胶中, rRNA与18S rRNA的比例约为 28S 2左右, 没有明显的5S rRNA, 总RNA的完整性良好 (图1A) 。测得A 260 /A 280 =1.863, 表明RNA的纯度很 高。RNA 于3 7 ℃下保育2 h (图1A,2) 与对照 , (图 1A,1) 无明显的差异, 表明RNA的稳定性良好, 完全 符合建库要求。 2.2 cDNA第一链合成及LD-PCR LD-PCR产物主要集中在0.4~3.0 kb 之间, 在 0.4 kb、 kb及接近1 kb处有较清晰的丰富带的产生(图 0.6 1B)。由于植物的mRNA相对而言较短, 因此, 在这个 范围内的cDNA是比较完整的。 2.3 cDNA的纯化与回收 过柱分离的cDNA片段主要集中于第六到第九 管中, 但第十管中已有十分明显的<500 bp的小片 段, 因此收集并回收第六到第九管的 c D N A, 用于 连 接实验。
RNA(A)与 LD-PCR cDNA (B )电泳检测 1.总 RNA; 2.在 37℃下温浴 2 h 的总 RNA; M. 1 kbDNA 分子标记; SM. 雪莲 cDNA;CK. 人胎盘 cDNA Fig.1 Total RNA from S. medusa(A) and LD-PCR cDNA(B) on 1.1% agarose 1.Total RNA; 2. Total RNA incubated at 37℃ for 2 h; M. 1 kb DNA ladder; SM. cDNA of S. medusa; CK. Human placenta cDNA 图1

64

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图 2 cDNA 文库插入片段大小及重组率检测 M. 1 kb DNA 分子标记; -CK. 阴性对照; 1~21. 单噬菌斑编号 Fig.2 Detection of inserts of the library and the combining rate M. 1 kb DNA ladder; -CK. Negative control; 1~21. The number of single plaques

2.4
6

cDNA文库的质量评价 三个试连接的原始文库滴度分别为1.5×

10 、 3.2×10 6 、 2.6×10 6 , 放大连接的原始文 库滴度达到 4 × 1 0 6 。扩增总文库滴度接近 1011。文库插入片段在0.5 kb到3 kb之间, kb 1 以上的占62% (图2) 最大片段约为3 kb , (图 2 未显示) 。重组率达到9 8 % 。 以雪莲CHS、 DFR、 Myb转录调控因子SmP 基因的特异引物从总文库中分别扩增出了169
图 3 文库特异基因检测 M. 100 bp DNA 分子标记; +CK. 阳性对照; -CK. 阴性对照; CHS. 查尔酮合酶 成中的两个关键酶基因, 它们的表达量较高, DFR. 二氢黄酮醇 -4- 还原酶; SmP. 水母雪莲 但SmP基因是Myb转录调控因子, 其表达量大 Myb 相关 P 基因 -6 -5 Fig.3 Gene special detection of the library 约为10 ~10 (金治平等, 2003), 仍能检测到阳 M. 100 bp DNA Ladder; +CK. Positive control; 性, 这表明文库的覆盖率很高, 足以获得目的 -CK. Negative control; CHS. chalcone synthase; 基 因 。 以 上 各 指 标 都 表 明 已 获 得 高 质 量 的 DFR. Dihydroflavonol 4-reductase; SmP. S. medusa Myb-related P gene cDNA 文库。

bp、 bp、 bp的带, 208 150 并与各自的阳性对照

相同 (图3) 。CHS与DFR是雪莲类黄酮生物合

3 讨论
构建cDNA文库的关键是要保证文库的完整性与覆盖度。本实验采用CLONTECH公司的 SMARTTM cDNA Library Construction Kit试剂盒及SMART (Switching Mechanism At 5' of end RNA Transcript) 技术, 构建了高质量的水母雪莲cDNA文库。SMART技术可以以微量的总 RNA (>50 ng) 为起始材料, 利用反转录酶的SMART特性 (在mRNA反转录结束时会自动在 第一链cDNA末端添加3个C的特性) 自动地将两端接头同时加在cDNA上, , 避免了mRNA的 纯化、 cDNA第二链合成、 甲基化、 接头平端连接等繁琐的操作, 大大简化了建库程序, 并减 少了RNA 降解的机会, 可以有效地保证cDNA 的完整性。水母雪莲cDNA 文库重组率达到 98%, 插入片段最大可达3 kb, 并从文库中检测到了类黄酮生物合成中的关键酶基因CHS、 DFR

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和对植物次生代谢有重要调控作用的R2R3 Myb 转录调控因子SmP基因, 不仅可以保存珍稀植 物水母雪莲的基因资源, 而且为克隆雪莲类黄酮代谢途径中的主要基因并进一步对该代谢途径 进行分子调控打下了坚实的基础。 用噬菌体直接做模板以目的基因的特异引物进行扩增, 可以 检测到强阳性信号, 这为用PCR对文库进行筛选提供了可能性 (Isola et al, 1991) 。 参 考 文 献
金治平,赵德修,乔传令,瞿文全,陈亚琼,付春祥, 2 0 0 3 . 水母雪莲 Myb 转录调控因子 S m P 基因的克隆 及序列分析,生物工程学报,1 9 :3 6 8 ~ 3 7 1 韩书亮, 1995. 大苞雪莲四种成分抗癌作用分析. 癌变畸变突变,7 (2): 80~83 Grotewold E , Chamberlin M , Snook M , Siame B , Butler L , Swenson J , Maddock S, Clair G S, Bowen B, 1998. Engineering secondary metabolism in maize cells by ectopic expression of transcription factors. The Plant Cell, 10:721~740 Isola N R , Harn H J, Cooper D L, 1991. Screening recombinant DNA libraries: a rapid and efficient method for isolating cDNA clones utilizing the PCR. Biotechnol Tech, 11:580~582 Koes R E , Quattrocchio F, Mol J N M, 1994. The flavonoid biosynthetic pathway in plants: function and evolution. BioEssays, 16(12): 123~132 Paz-Ares J , Ghosal D , Wienand U , Peterson P A, Saedler H, 1987. The regulatory c1 locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators. EMBO J, 6: 3553~3558 Roth B A , Goff S A , Klein T M , Fromm M E, 1991. C1-and R-dependent expression of the Maize Bz1 gene requires sequences with homology to mammalian myb and myc binding sites. The Plant Cell, 3: 317~325


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