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第六章核糖体和核酶


1. 发现核糖体及核糖体功能鉴定的两个关键技术是什么? 答: 核糖体最早是 Albert Claude 于 1930s 后期用暗视野显微镜观察细胞的匀浆物 时发现的,当时称为微体(Microsomes),直到 1950s 中期,George Palade 在电子 显微镜下观察到这种颗粒的存在。当时 George Palade 和他的同事研究了多种生 物的细胞,发现细胞质中有类似的颗粒存在,尤其在进行蛋白质合成的细胞中特 别多。后来 Philip Siekevitz 用亚细胞组份分离技术分离了这种颗粒,并发现这些 颗粒总是伴随内质网微粒体一起沉积。化学分析揭示,这种微粒富含核苷酸,随 之命名为 ribosome,主要成分是核糖体 RNA(rRNA),约占 60%、蛋白质(r 蛋白 质)约占 40%。核糖体的蛋白质合成功能是通过放射性标记实验发现的。将细胞 与放射性标记的氨基酸短暂接触后进行匀浆,然后分级分离,发现在微粒体部分 有大量新合成的放射性标记的蛋白质。后将微粒体部分进一步分离,得到核糖体 和膜微粒,这一实验结果表明核糖体与蛋白质合成有关。两个关键技术是亚细胞 组份分离技术和放射性标记技术。 2.说明人体单倍体染色体组中四种 rRNA 基因的组成、排列方式和拷贝数。 答: 在人基因组的四种 rRNA 基因中, 18S、5.8S 和 28S rRNA 基因是串联在一 起的,每个基因被间隔区隔开, 5S 的 rRNA 基因则是编码在另一条染色体上。 前 3 个基因组成一组, 分布在人的 13、14、15、21、22 等 5 条染色体上。在 间期核中,所有这 5 条染色体 rRNA 基因区域, 转录时聚集在一起, 形成一个 核仁。在人体单倍体染色体组中, 每组 rRNA 基因有 200 个拷贝。每一拷贝为 一个 rDNA 转录单位。这 3 个基因是纵向串联排列在核仁组织者的 DNA 上。真 核细胞核糖体的 5S rRNA 基因则是独立存在于一个或几个染色体上, 拷贝数达 几千个。在人的细胞中, 该基因的拷贝有 24000 个之多, 它们串联排列在 1 号染色体接近末端处。 3.根据 3H 标记的尿嘧啶和放线菌素 D 研究人的培养细胞前体 rRNA 的合成, 推测出前体 rRNA 的加工过程, 请问 3H 标记的尿嘧啶和放线菌素 D 各起什么 作用? 答: 3H 标记的尿嘧啶是追踪 RNA 的, 而加入放线菌素 D 是为了阻断 RNA 的合 成, 这样随着 RNA 加工的进程, rRNA 分子越来越小, 便于判断。如果不阻 断 RNA 合成, 新合成的 45SrRNA 就会干扰判断。在上述的研究中发现, 当 人的细胞同 3H 标记的尿嘧啶共培养 25 分钟后, 被标记 rRNA 的沉降系数是 45S, 加入放线菌素 D 阻断 RNA 的合成后, 标记的 45S rRNA 首先转变成 32S 的 rRNA, 随着培养时间的延长,逐渐出现被标记的 28S、18S 的 rRNA。 4. 有人用核糖体重组实验得到一些重要的结论,你能说出一、二吗? 答: 这些结果包括以下几个方面:①30S 亚基的蛋白质专同 16S rRNA 结合; 50S 亚基的蛋白质只同 23S rRNA 结合, 如果把 30S 亚基 rRNA 和 50S 亚基的蛋白质 相混合,则不能装配成有功能的亚基。②从不同种细菌提取 30S 亚基的 rRNA 和蛋白质, 可装配成有功能的 30S 亚基, 这表明不存在种间差异。③原核生 物核糖体与真核生物核糖体的亚基彼此不同, 由二者的 rRNA 和蛋白质重组后 的核糖体没有功能。 ④大肠杆菌的核糖体与玉米叶绿体核糖体亚基重组后具有功 能。⑤由于不同生物的线粒体核糖体大小不同,由 55S 到 80S 不等, 而原核生 物的核糖体基本稳定, 所以线粒体的核糖体亚基同原核生物核糖体亚基相互交换 形成的杂合核糖体没有功能。 5. 真核细胞中核糖体的合成和装配过程如何? 答: 整个过程相当复杂, 首先要合成与核糖体装配有关的蛋白质,这些蛋白质

包括核糖体结构蛋白和与前体 rRNA 加工有关的酶。 它们都是在细胞质的游离核 糖体上合成,然后迅速集中到细胞核并在核仁区参与核糖体亚基的装配。而组成 核糖体亚基的 18S rRNA、 SrRNA 和 28S rRNA 基因则是在核仁中边转录边参 5.8 与核糖体亚基的装配, 5S rRNA 却是在细胞核中转录后运送到核仁中参与核糖 体亚基的装配。装配过程中,45S RNA、5S RNA 同蛋白质形成 80S RNA 颗粒, 然后 80S 颗粒被降解成大小两个颗粒, 大颗粒为 55S, 含有 32S 和 5S 两种 RNA, 小颗粒含有 20S 的前体 rRNA。 然后, 小颗粒中的 20S RNA 前体被快速降解成 18S 的 rRNA,并运送到细胞质中,即是成熟的核糖体小亚基。55S 大颗粒中的 32S RNA 被加工形成 28S 和 5.8S 两种 rRNA 成为成熟的大亚基后,被运送到细胞 质中,这个过程比较慢。如果这时有 mRNA 同小亚基结合的话,大亚基即可结 合上去形成完整的核糖体,并进行蛋白质的合成。 6. 二十世纪六十年代初期 Robert Perry 发现核糖体的合成是在核仁中进行的, 请问他是如何发现的? 答: 二十世纪六十年代初期 Robert Perry 用紫外微光束破坏活细胞的核仁,发现 破坏了核仁的细胞丧失合成 rRNA 的能力, 这一发现提示核仁与核糖体的形成有 关。后来 Perry 又发现低浓度的放线菌素 D 能够抑制 3H-尿嘧啶掺入 rRNA 中, 而不影响其他种类的 RNA 合成。 显微放射自显影也显示放线菌素 D 能够选择性 阻止核仁 RNA 的合成,表明核仁与 rRNA 的合成有关。 7. 原核生物蛋白质合成起始复合物形成包括哪些过程?需要哪些因子参与? 答: 主要分为三步, 参与的因子包括起始因子 1-3,以及 mRNA、转运 tRNA、 GTP 等。①30S 亚基与 mRNA 的结合 mRNA 不能与完整的核糖体结合,但是能 够同独立存在的 30S 核糖体小亚基结合。在原核生物中,30S 核糖体小亚基通过 16S rRNA 与 mRNA 起始密码子 AUG 上游的 SD 序列的互补,从而与 mRNA 结 合。核糖体小亚基与 mRNA 的结合还需要起始因子(initiation factor. IF)的帮助, 原核生物的起始因子命名为 IFs,真核生物的起始因子命名为 eIFs。原核生物有 三种起始因子,其中有两种(IF1、IF3)通过与 30S 核糖体亚基的结合帮助 30S 亚 基与 mRNA 的识别与结合。 第一个 aa-tRNA 进入核糖体 当 mRNA 与核糖体 ② 小亚基结合后, 携带甲酰甲硫氨酸的 tRNA 通过反密码子与 mRNA 中 AUG 的识 别从而进入核糖体。起始 tRNA 在与 mRNA 形成 mRNA-30S 亚基复合物之前, 必须同 GTP、起始因子 IF2 结合,形成 GTP-IF2-tRNAfMet 复合物。起始 tRNA 复合物与 mRNA 的 AUG 密码子结合后, 释放 IF3。 完整起始复合物的装配 一 ③ 旦起始 tRNA 与 AUG 密码子结合,核糖体大亚基就加入到复合物中形成完整的 核糖体-mRNA 起始复合物。该过程伴随 GTP 的水解、IF1 和 IF2 的释放。其中 GTP 的水解可能引起核糖体构型的变化,而改变了的构型正是蛋白质合成所必 需的。 8. 请详细说明多肽链延伸的过程。 答: 蛋白质合成的肽链延伸涉及四个重复的步骤∶①氨酰 tRNA 进入核糖体的 A 位点;②肽键形成;③转位;④脱氨酰 tRNA 释放。上述四步的循环,使肽链不 断延长。在整个过程中,需要 GTP 和一些延长因子的参与。①氨酰-tRNA 进入 A 位由于起始 tRNA 占据 P 位点,核糖体开始接受第二个氨酰-tRNA 进入 A 位 点,此即为延伸的第一步。第二个氨酰-tRNA 在进入 A 位点之前,必须与结合 有 GTP 的蛋白延伸因子结合(原核细胞中延伸因子是 Tu,真核生物则是 eEF1)。 Tu 起传递作用,即将氨酰-tRNA 传递给核糖体。虽然任何氨酰-tRNA-Tu-GTP 都 有可能进入 A 位,但只有反密码子与 A 位点密码子相匹配的 tRNA 才允许进入

A 位。 一旦合适的氨酰-tRNA-Tu-GTP 同 A 位点的密码子结合, GTP 水解, Tu-GDP 被释放。②肽键形成当核糖体的 P 位和 A 位都有 tRNA 占据时,进入核糖体的 两个氨基酸是分开的,所以延伸反应的第二步是两个氨基酸相互作用,通过肽键 的形成将两个氨基酸结合起来。即由 A 位的 aa-tRNA 上氨基酸的氨基与 P 位 aa-tRNA 上氨基酸的羧基间形成肽键, 使 P 位的 tRNA 卸去氨基酸,而 A 位上 的 tRNA 形成了二肽。肽键的形成是自动发生的,不需要额外的能量。这一反应 是由肽酰转移酶(peptidyl transferase)催化的,该酶是核糖体大亚基的组成成份。 多年来一直认为肽酰转移酶是组成 50S 亚基的一种蛋白, 现在已经清楚, 它是构 成核糖体的 RNA,是核酶。③转位(translocation) 当形成了第一个肽键时,A 位 点上的 tRNA 分子的一端仍然与 mRNA 的密码子结合,而另一端与肽结合.此时 P 位点上的 tRNA 没有氨基酸的结合。接下来进入延伸反应的第三步:转位,即核 糖体沿着 mRNA 从 5'→3'方向移动三个核苷酸(一个密码子),在此过程中,A 位的 tRNA-二肽移到 P 位, P 位的 tRNA 则进入 E 位点。 而 转位需要另一个 GTP 结合的延伸因子的参与(原核生物是延伸因子 G,真核生物是延伸因子 eEF2)。 GTP 水解释放的能量转变成机械能,将核糖体沿着 mRNA 移动大约 1 nm。④脱 氨酰 tRNA 的释放 延伸反应的最后一步是脱氨酰 tRNA 离开核糖体的 E 位点。 一旦肽酰 tRNA 转位到 P 位,A 位点再次开放,接受下一个 aa-tRNA。在这种情 开始下一个循环。 况下, 进入的氨酰-tRNA 的反密码子必须与第三个密码子互补, 在蛋白质合成的延伸反应中,每一次循环至少水解两分子的 GTP, 耗时二十分 之一秒,速度之快是惊人的。 9. 在肽链延伸过程中 tRNA 的转位是是如何进行的? 答: 通过足迹法(footprinting)分析,揭示在蛋白质合成的延伸循环中,tRNA 的转 位是分两步进行的,并且相互独立(图 Q6-1)。①肽键的形成引起新形成的肽酰 tRNA 大亚基的受体部分从 A 位向 P 位偏移, 而它的小亚基的反密码子部分仍然 新形成脱氨酰 tRNA 的受 与 A 位的密码子相连(此时的状态称为 A/P 结合状态)。 体从大亚基的 P 位向 E 位偏移,而它的反密码子部分仍然在小亚基的 P 位,此 时的状态称为 P/E 结合状态。 ②核糖体与 EF-G-tRNA 复合物结合,引起这些 tRNA 的反密码子的末端与它们 结合的 mRNA 一起相对于小亚基移动,使得肽酰-tRNA 完全占据大、小亚基的 P 位点(P/P 结合状态),而脱氨酰 tRNA 则完全移到大亚基的 E 位点。 10. 多聚核糖体形成的意义何在? 答: 同一条 mRNA 被多个核糖体同时翻译成 蛋白质,大大提高了蛋白质合成的速率,更重要的是减轻了细胞核的负荷, 减 少了基因的拷贝数, 也也减轻了细胞核进行基因转录和加工的压力。 11. 如何根据嘌呤霉素实验的结果判断核糖体中的 A、 是两个分开的独立位点? P 答: 可以这样分析:在第一组实验中,只有起始 tRNA 占据 P 位,如果 A 位点是 一个独立位点的话,此时的 A 位点就是空闲的,嘌呤霉素当然能够结合上去, 如果 A 位点与 P 位点是同一位点,那么嘌呤霉素就不能与核糖体结合,实验结 果是嘌呤霉素能够结合。在第二组实验中,由于 A 位点已经被二肽酰 tRNA 占 据,所以嘌呤霉素无法与 A 位点结合,只有加入延伸因子和 GTP 后,使 A 位点 腾空,嘌呤霉素才能结合到核糖体上。因此两根据这两组实验结果可以断定 A、 P 是两个独立的功能位点。 12. 根据原核细胞中反义 RNA 作用方式的不同分为三类,请推测它们的作用方 式有什么不同? 答: 这三类反义 RNA 的作用特点分别是:I 类反义 RNA 直接作用于其靶 mRNA

的 SD 序列和/或编码区,引起翻译的直接抑制(1A 类); 或与靶 mRNA 结合后引 起该双链 RNA 分子对 RNA 酶Ⅲ的敏感性增加, 使其降解(1B 类)。Ⅱ类反义 RNA 与 mRNA 的 SD 序列的上游非编码区结合,从而抑制靶 mRNA 的翻译功 能,其作用机理尚不清楚,可能是反义 RNA 与靶 mRNA 上游序列结合后, 会 引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变, 从而抑制了与核糖体的结合。 Ⅲ类反义 RNA 可直接抑制靶 mRNA 的转录:如 tic RNA(transcriptioninhibitory complementary RNA)是大肠杆菌中 CAP 蛋白(cAMP 结合蛋白)的 mRNA 的反义 RNA。ticRNA 基因的启动子可被 cAMP-CAP 复合物所激活,从 CAP mRNA 的 转录起始位点上游 3 个核苷酸处开始, 以 CAP mRNA 的模板 DNA 链的互补链 为模板, 合成 ticRNA。ticRNA 的具体长度不清楚, 但是它的 5'端一段正好 和 CAP mRNA 的 5'端有不完全互补,可以形成 RNA 双链杂合体。而在 CAP mRNA 上紧随杂交区之后的是一段约长 11bp 的 A?U 丰富区。这样的结构与 ρ 因子不依赖性的转录终止子的结构十分相似,可以使 CAP mRNA 的转录刚刚开 始不久即迅速终止。这一例子是 CAP 蛋白合成的自我调节的最好说明。当 CAP 合成达到一定量之后, 即与 cAMP 结合形成 cAMP-CAP 复合物, 再激活 ticRNA 的启动子转录出 ticRNA, 反过来抑制 CAP-mRNA 的合成。 13. 核酶是如何被发现及证实的? 这一发现有什么意义? 答: 1981 年,Thomas Cech 和他的同事在研究四膜虫的 26S rRNA 前体加工去除 基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和 纯化的 26S rRNA 前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中, 可能的解释只能是: 内含子切除是由 26S rRNA 前体自身催化的, 而不是蛋白质。 为了证明这一发现, 他们将编码 26S rRNA 前体 DNA 克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成 26S rRNA 前体分子。结果发现这种人工制备的 26S rRNA 前体分子在没有任何蛋白 质催化剂存在的情况下,切除了前体分子中的内含子。这种现象称为自我剪接 (self-splicing),这是人类第一次发现 RNA 具有催化化学反应的活性,具有这种 催化活性的 RNA 称为核酶。这一发现之后不久,在酵母和真菌的线粒体 mRNA 和 tRNA 前体加工、 叶绿体的 tRNA 和 rRNA 前体加工、 某些细菌病毒的 mRNA 前体加工中都发现了自我剪接现象。Thomas Cech 因发现了核酶而获得 1989 年 诺贝尔化学奖。核酶的发现在生命科学中具有重要意义,在进化上使我们有理由 推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的, 只是在进化的某一进程中蛋 白质和核酸分别执行不同的功能。核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手 段,具有重要的应用前景。 14. 说明核剪接的套索模型的机理。 答: 内含子的剪接分为两个主要的阶段。 第一阶段是从内含子的 5' 端开始切割, 将左边的外显子与右边的内含子-外显子分开,左边的外显子是一个线性分子, 右边的内含子-外显子形成一个套索结构,在套索结构中,内含子的 5'端同内含 子右侧一个碱基相连形成一个环。第二个阶段是在剪接位点的 3'端切割,释放 套索中的内含子,同时右边的外显子与左边的外显子连接起来,切割和连接反应 不是独立的,而是协同进行的。在这一过程中要由 U1、U2、U4/U6、U5 snRNP 装配成剪接体。首先是由 U1 和 U2 snRNPs 结合到内含子的两侧, 然后 U4/U6 复合物和 U5 结合上来形成无活性的剪接体, 无活性剪接体经过重排, 将 U1 和 U4 排除出去,形成活性剪接体,然后将内含子切除。


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