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实验七 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇


实验七 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇 实验八 二乙酰一肟法测定血清尿素
课程名称:生物化学与分子生物学实验课 课程名称:生物化学与分子生物学实验课 与分子生物学 专业,层次:临床,营养与食品,口腔本科 专业,层次:临床,营养与食品,口腔本科 职称: 职称:讲师 基本教材:自编 《生物化学与分子生物学实验指导》 基本教材: 生物化学与分子生物学实验指导》 年级: 年级:2005 授课教师: 授课教师:符伟玉 学时: 学时:4 学时

教学目的与要求: 教学目的与要求: 1,掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法. 2,学习用比色法测定血清尿素. 3,巩固有关胆固醇和尿素的知识. 4,进一步熟练 UV2100 型分光光度计的使用.

大体内容与时间安排: 大体内容与时间安排: 1,氧化酶法测定总胆固醇的原理 2,氧化酶法测定总胆固醇的注意事项 3,二乙酰一肟法测定血清尿素的原理 3,二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 4,学生做实验 5min 5min 5min 5min 140min

教学方法: 教学方法:讲授式+启发式

教学重点,难点: 教学重点,难点: 重点:1,氧化酶法测定总胆固醇的原理 2,二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 难点:氧化酶法测定总胆固醇的原理

一,实验原理
(一)氧化酶法测定血清总胆固醇 氧化酶法测定血清总胆固醇 血清总胆固醇(TC)包括: 游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分. 本实验是 胆固醇酯酶,胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应. 第一步:血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸 (FFA) . 第二步:胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和 H2O2. 第三步:H2O2 在 4-氨基安替比林和酚存在时,经过氧化物酶催化,反应生 成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物,其颜色深浅与标本中 TC 含 量成正比. (二)二乙酰一肟法测定血清尿素 二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的 4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物,颜 色深浅与尿素含量成正比.因二乙酰不稳定,故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用 产生二乙酰.

二,操作步骤
(一)氧化酶法测定血清总胆固醇 氧化酶法测定血清总胆固醇 终点法检测 TC,取试管 3 支按下表依次加样. 酶法测定 TC 操作步骤 加入物(μl) 血清 标准液或定值血清 蒸馏水 酶试剂 空白管 - - 20 1 000 标准管 - 20 - 1 000 测定管 20 - - 1 000

混匀后,37℃保温 10 min,每管加 3ml 水混匀,用分光光度计比色,于 500 nm 波长处以空白管调零,读出各管吸光度.

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(二)二乙酰一肟法测定血清尿素 取试管 3 支,按下表依次加样. 二乙酰一肟法操作步骤 加入物(ml) 血清 尿素标准应用液 蒸馏水 二乙酰一肟溶液 酸性试剂 空白管 - - 0.02 0.5 5.0 标准管 - 0.02 - 0.5 5.0 测定管 0.02 - - 0.5 5.0

混匀,置沸水浴加热 12min,取出置冷水中冷却 5min,以空白管调零,在 540nm 处读取各管吸光度.

三,注意事项
(一)氧化酶法测定血清总胆固醇 氧化酶法测定血清总胆固醇 1,最后加酶试剂,各管反应时间应一致; 2,比色应在 30min 内完成; 3,试管在操作前尽量保持干燥; 4,试剂中酶的质量影响测定结果 ; 5,若需检测游离胆固醇浓度,将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可. (二)二乙酰一肟法测定血清尿素 1,试剂中加入氨基硫脲和镉离子,可增进显色强度和色泽稳定性,但仍有轻度 褪色现象,(每小时小于 5%).煮沸显色经冷却后,应及时比色. 2, 尿液中尿素也可用此法测定, 但因浓度高, 需先用去离子水作 50 倍以上稀释. 3,注意洁净干燥,加量务必准确. 4,水浴时注意打开水浴箱盖,以免水汽入管. 5,酸性试剂中酸的含量较浓,要小心使用.

四,思考题
1. 血清胆固醇浓度升高或降低有何临床意义? 2. 血清尿素浓度升高或降低有何临床意义? 3. 血清非蛋白氮(NPN)与尿素的区别,它包括哪些?

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氧化酶法测定血清总胆固醇,此方法特异性好和灵敏度高,既可用于手工操 作,也可自动化分析;既可作终点法检测,也可作速率法检测.在终点法中血红 蛋白高于 2g/L 时引起正干扰;胆红素高于 0.1g/L 时有明显负干扰;血中维生素 C 与甲基多巴浓度高于治疗水平时,会使结果降低.但是在速率法中上述干扰物 质影响较小.高 TG 血症对本法无明显影响.检测 TC 的血清(浆)标本密闭保存 时,在 4℃可稳定 1 周,-20℃可稳定半年以上. 二乙酰一肟法测定血清尿素, 试剂单一, 方法简便, 但试剂具毒性和腐蚀性. 在标本数量多时加热开始难以达到 100℃,各管间受热温度也可能不一致,因而 本法重复性不佳. 若改善加热条件, 如采用在水浴锅底部加置高约 5mm 的网垫, 在网垫上加热显色,可使 CV 由不加网垫时的 6.46%降至 2.99%.线性上限仅达 7.14mmol/L;回收率为 96%~102.1%.二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存 在的含氮化合物.很多其它化合物在结构中会有尿素的残基,如瓜氨酸,四氧嘧 啶和尿囊素, 虽然也会产生一种带颜色的产物, 但这些化合物在血清中浓度很低, 故很少引起明显的干扰.另一些其它的化合物在血清中浓度高,但这些色素的最 大吸收峰不同,因此不产生明显干扰.胆红素达 171μmol/L,血红蛋白达 10g/L 均无影响.

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